多粘菌素B聯合不同抗菌藥物對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌作用

吳正海，劉海洋，陳華樂，段達榮，周鐵麗

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院醫學檢驗中心，浙江 溫州 325027；3.臺州市第一人民醫院 醫學檢驗中心，浙江 臺州 318020）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）為條件致病菌，是導致院內感染和社區獲得性感染最常見的病原體之一。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）在全球范圍內呈現不斷增多趨勢，給臨床治療帶來極大困難[1]。多粘菌素早期因腎毒性及神經毒性被限制使用，近年來由于多重耐藥菌的出現及蔓延被重新啟用，被視為治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”。但隨著多粘菌素的廣泛使用，部分菌株尤其是CRKP中出現多粘菌素耐藥性，給臨床治療帶來極大挑戰。為了有效控制CRKP所致嚴重感染，防止耐藥性的進一步產生，聯合用藥成為一個較好的選擇[2]。本研究采用微量肉湯棋盤稀釋法探究多粘菌素B分別與美羅培南和利福平聯合用藥對CRKP的體外抗菌活性，為臨床治療CRKP感染提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源：收集2016年12月至2017年4月臺州市第一人民醫院CRKP共20株，菌株收集時剔除同一患者同一部位分離的重復菌株。其中分離自尿液、痰液和血液標本的菌株分別為9株、10株和1株。所有菌株均由VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定并進行藥敏檢測，瓊脂稀釋法確認藥敏結果。20株菌經改良Hodge實驗證實均為產碳青霉烯酶菌株，且其中有15株為多重耐藥菌。藥敏質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853，均購自衛生部臨床檢驗中心。

1.1.2 儀器和試劑：VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀、DR100型比濁儀（法國生物梅里埃公司），超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器公司），96孔平板（上海雷布斯生物科技有限公司）；MH肉湯培養基（濟南安貝卡有限公司），無菌接種水、多粘菌素標準品（溫州康泰生物公司），利福平（廣東華南藥業集團有限公司），美羅培南（海正輝瑞藥業有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液配置：從已經分純并過夜培養的血瓊脂平板上挑取3～5個菌落，并接種于無菌0.9%氯化鈉溶液中。菌液用比濁儀調濁度至0.5麥氏濁度，再用MH肉湯稀釋100倍。

1.2.2 抗菌藥物配置：根據美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準[3]的要求配置各種抗菌藥物原液，利福平、美羅培南和多粘菌素B原液濃度均為5 120 μg/mL。

1.2.3 微量肉湯稀釋法：將各抗菌藥物用MH肉湯進行倍比稀釋，制成10個稀釋濃度。多粘菌素B濃度為0.5～256 μg/mL，利福平濃度為2.5～1 280 μg/mL，美羅培南濃度為5～2 560 μg/mL。向無菌的96孔平板中每行的第1～第10孔加入100 μL的各濃度藥液，再向各孔加入100 μL稀釋后的菌液，同時做陰性對照和空白對照。37 ℃培養16～18 h，觀察結果并記錄各種藥物單用時的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值（單藥MIC）。重復操作3次取平均值。

1.2.4 微量棋盤稀釋法：將各種藥物根據2倍MIC值用MH肉湯倍比稀釋成8個濃度梯度。分別取多粘菌素B和美羅培南、多粘菌素B和利福平組合，按照棋盤法設計，各取50 μL加入每孔，同時加入100 μL稀釋后的菌液，37 ℃培養16～18 h后，觀察記錄最佳組合時的各藥M I C（甲藥聯用M I C和乙藥聯用M I C）。并計算部分抑菌·濃度指數（f r a c t i o n a l i n h i b i t o r y concentration index，FICI）值。

1.2.5 FICI計算與判讀：FICI=MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用。FICI≤0.5為協同作用，0.5＜FICI≤1.0為相加作用，1.0＜FICI≤2.0為無關作用，FICI＞2.0為拮抗作用。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析。2組藥物組合間的協同率比較采用χ2檢驗，檢驗水準取α=0.05。

2 結果

2.1 藥物單用和聯用對CRKP的MIC比較 多粘菌素B和美羅培南聯用后，兩者的MIC5（0能抑制50%的細菌所需MIC）與MIC9（0能抑制90%的細菌所需MIC）明顯下降：多粘菌素B的MIC50與MIC90均為單藥的1/4，美羅培南的MIC50與MIC90為單藥的1/32和1/4；多粘菌素B和利福平聯用后，多粘菌素B的MIC50與MIC90分別為單藥的1/32和1/8，利福平的MIC50與MIC90分別為單藥的1/2和1/64。表明上述兩種藥物與多粘菌素B之間均具有一定的聯合效應。見表1。

2.2 濃度-累積抑菌百分率曲線 多粘菌素B與美羅培南、利福平聯合用藥后，各藥物的濃度-累積抑菌百分率曲線均表現為左移，表明各藥物組合后的抑菌所需藥物濃度與單藥時相比均有所降低。見圖1-2。

表1 多粘菌素B與美羅培南、利福平單用和聯用對CRKP的MIC值（n=20，μg/mL）

2.3 藥物聯用對CRKP的FICI分布及兩藥物組合間協同率比較 多粘菌素B與美羅培南聯用后，協同作用為55%，相加作用為45%，無關和拮抗作用均為0；多粘菌素B與利福平聯用后，協同作用為65%，相加作用為35%，無關和拮抗作用均為0。表明上述兩種藥物與多粘菌素B組合均有一定的聯合效應。各組藥物對CRKP的FICI分布見表2。兩藥物組合間的協同率（協同作用+相加作用）差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 多粘菌素B、美羅培南單用和聯用對CRKP的濃度-累積抑菌百分率曲線（n=20）

圖2 多粘菌素B、利福平單用和聯用對CRKP的濃度-累積抑菌百分率曲線（n=20）

3 討論

KP屬腸桿菌科，為革蘭陰性桿菌，對外界抵抗力強，可存在于人體腸道和上呼吸道，一般情況下不致病，在機體抵抗力下降時引發尿路感染、肺炎、菌血癥等[4]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療多重耐藥KP感染的有效手段，然而據我國CHINET細菌耐藥性監測報告[5]，CRKP檢出率逐年上升，耐藥性的獲得途徑多樣，包括產碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失、膜通透性改變和外排泵過表達等，給臨床抗感染治療帶來巨大的挑戰[6]。因此，以多粘菌素為基礎的針對耐碳青霉烯類革蘭陰性菌的聯合用藥方案評價對于臨床應用具有重要意義。

本研究通過多粘菌素B分別與美羅培南和利福平聯合藥敏的方式，對20株CRKP進行體外抗菌活性的研究。結果顯示，兩藥與多粘菌素B聯用后，各藥的MIC50與MIC90值較單用時有明顯降低，累積抑菌濃度百分率曲線明顯左移。多粘菌素B與美羅培南聯用后，協同作用為55%（11/20），相加作用為45%（9/20），無關與拮抗作用均為0；多粘菌素B與利福平聯合用藥后，協同作用為65%（13/20），相加作用為35%（7/20），無關和拮抗作用均為0。兩種組合均對CRKP具有良好的抑菌作用，且聯合抑菌效果相似。BRATU等[7]通過利福平與多粘菌素B聯合用藥對KP進行抗菌效果評價時發現，16株菌中有15株出現協同作用；亞胺培南與多粘菌素B聯合，有10株出現協同作用，3株出現拮抗作用。本研究結果顯示多粘菌素B與利福平聯合用藥的結果與BRATU等的結果基本相同，多粘菌素B與美羅培南聯合用藥的結果與其報道的多粘菌素B與亞胺培南聯合用藥結果的差異較大，但與ELEMAM等[8]報道相似，這可能與藥物的抗菌效果及菌株特異性有關。TASCINI等[9]研究結果顯示多粘菌素B和與利福平聯合用藥同樣對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniaecarbapenemase，KPC）的菌株具有協同作用；QURESHI等[10]的研究表明，多粘菌素B與碳青霉烯類藥物的聯合應用能降低KPC造成的感染致死率。然而，WAREHAM等[11]體外評價多粘菌素B在與利福平、亞胺培南或阿奇霉素聯合用藥對多重耐藥鮑曼不動桿菌的活性時發現，協同作用不具有普遍性，這可能與菌株特異性及地區差異性有關。

表2 多粘菌素B分別與美羅培南、利福平聯用對20株CRKP的FICI分布構成[ n（%）]

與此同時，相關研究顯示革蘭陰性菌對多粘菌素的耐藥率已從0.1%增長到31.0%，并出現了碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌對多粘菌素B耐藥的泛耐藥菌株，尤以KP最為多見[12]。本研究發現其中兩例多粘菌素B單用時的MIC值分別為8 μg/mL和4 μg/mL，需引起高度重視。因此，在控制CRKP感染時需優先選擇聯合用藥，防止多粘菌素耐藥的進一步產生。

綜上所述，以多粘菌素B為基礎的聯合用藥，既對CRKP產生一定的抑菌效果，又可以降低用藥劑量，延緩細菌耐藥性的產生，為臨床抗感染治療帶來新的選擇。此外，應進一步對多粘菌素B及其聯合用藥的藥代動力學（pharmacokinetics，PK）/藥效動力學（pharmacodynamics，PD）參數和腎損傷機制及危險因素進行研究，解決以其為基礎的聯合用藥對于臨床的有效性和安全性的問題，制定科學合理的用藥措施，促使以多粘菌素B為基礎的聯合用藥方案切實成為臨床戰勝嚴重感染的有力武器。

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