慢性低O2高CO2對小鼠海馬細胞凋亡、caspase-3和p38 MAPK活性的影響

任惠明，王小同，袁海，康翰林

（1.寧波市第二醫院 康復醫學科，浙江 寧波 315010；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 腦科康復中心，浙江 溫州 325027；3.合肥市第二人民醫院 康復醫學科，安徽 合肥 230011；4.贛南醫學院第一附屬醫院 神經內科，江西 贛州 341000）

慢性低O2高CO2普遍存在于慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）等呼吸系統疾病患者中。COPD患者可伴有明顯認知功能障礙，增加COPD患者急性加重的風險，導致日常活動受限，增加住院率和病死率[1]。OSAS患者也存在認知功能損害，尤以記憶功能減退為突出表現[2]。慢性低O2高CO2模型可以模擬這類疾病的病理生理過程，進一步研究該類疾病引起的認知功能障礙[3-4]。已有研究發現海馬細胞凋亡可能是慢性低O2高CO2導致腦功能損害的重要機制之一[5]，但具體機制尚未明確。p38 MAPK屬于應激激活的蛋白激酶，參與了多種因素所致的神經細胞凋亡，是近些年研究的熱點[6]，caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶之一。本研究通過建立慢性低O2高CO2小鼠模型，觀察海馬細胞凋亡以及p38 MAPK、caspase-3活性情況，初步探討慢性低O2高CO2模型小鼠海馬細胞的凋亡機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性C57BL/6小鼠24只，9～10月齡，體質量26～28 g，溫州醫科大學實驗動物中心SPF條件下繁殖，動物使用許可證號：wydy 2012-0079。

1.1.2 儀器和試劑：常壓低O2高CO2艙（溫州醫科大學肺心病研究室制），CYESIl型O2、CO2氣體測定儀（上海市嘉定學聯儀表廠），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標儀（美國ABI公司）。兔抗鼠磷酸化p38 MAPK、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗、β-tublin抗體均購自美國Cell Signal Technology公司，caspase-3活性測定試盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：雄性C57BL/6小鼠24只隨機分為2組，分別為正常對照組（NC組）、低O2高CO24周組（4HH），每組12只。參照文獻方法[7]，將4HH組小鼠置于常壓低O2高CO2艙內，通過N2調節艙內O2濃度維持在9%～11%，CO2濃度為5.5%～6.5%，每天8 h，每周6 d。其余時間與NC組在同一室內（室溫15～20 ℃，相對濕度50%～70%），持續4周。

1.2.2 取材：造模結束后腹腔注射戊巴比妥鈉行全身麻醉，仰臥固定，0.9%氯化鈉溶液心臟灌注，斷頭，剝離顱骨，快速分離海馬，取左半放入液氮保存，右半放入4%多聚甲醛中固定，分別用于p38 MAPK、caspase-3活性測定和凋亡指數（apoptosis index，AI）測定。

1.2.3 海馬CA1區細胞AI檢測（原位缺口末端標記TUNEL法）：石蠟切片常規脫蠟、水化，按照試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察，有熒光顯示者為凋亡細胞。每張切片隨機取5個視野，記錄凋亡細胞數，AI用凋亡細胞數/100表示，同一張切片由3名不同實驗人員讀數，并取平均值。

1.2.4 caspase-3活性檢測：按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，取海馬組織稱重，每10 mg組織加入100 μL裂解液，冰浴勻漿。勻漿液轉移到1.5 mL離心管中，冰浴裂解5 min，4 ℃ 20 000轉離心15 min。將上清、反應緩沖液、底物（AC-DEVD-ρNA）加至酶標板37 ℃孵育1 h，酶標儀405 nm波長測定吸光度（A）值，重復測量3次取平均值。

1.2.5 Western blot檢測海馬p-p38 MAPK蛋白含量：蛋白裂解液提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Pierce公司）測定蛋白濃度，依次進行SDSPAGE電泳（10%分離膠、4%濃縮膠）、轉膜、封閉，孵育盒中注入5% BSA稀釋的兔抗鼠磷酸化p38 MAPK單克隆抗體（1∶500）及內參β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜之后注入HRP標記的羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h后化學發光檢測試劑反應5 min，接著在暗室中用X膠片感光，然后顯影90 s，最后定影3 min。Quantity One凝膠軟件系統分析磷酸化p-p38 MAPK和內參β-actin光密度值，蛋白磷酸化p38 MAPK條帶光密度和內參β-actin光密度比值代表p-p38 MAPK的光密度值，重復3次獨立試驗。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0分析軟件進行數據處理。所有數據進行正態性檢驗，正態性計量資料以 ±s表示；多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較用Levene進行方差齊性檢驗，方差齊用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬細胞AI NC組偶見細胞凋亡，AI為1.23±0.32，4HH組細胞凋亡較NC組明顯增加，AI為7.38±1.29，2組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。2.2 海馬caspase-3活性 NC組caspase-3活性偏低，為0.0205±0.0035，4HH組caspase-3活性較NC組明顯增加，為0.0718±0.0085，2組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 海馬p-p38 MAPK蛋白含量 NC組p-p38 MAPK相對蛋白含量較低，為0.25±0.022，4HH組p-p38 MAPK相對蛋白含量為0.46±0.052，較NC組明顯增加，2組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 2組小鼠海馬凋亡細胞（TUNEL，×400）

圖2 2組小鼠海馬p-p38 MAPK的表達量

3 討論

MAPK是哺乳動物體內重要的細胞信號轉導系統，一般位于胞漿，受刺激后磷酸化而活化，然后進入細胞核內，通過激活靶基因而參與細胞生長、發育、分化以及凋亡等病理生理過程，MAPK家族成員主要有Erk1/2、JNK、p38以及Erk5[8]。p38是由360個氨基酸組成的38 kD的蛋白，可被多種應激反應激活，因此與JNK一起被稱為應激激活的蛋白激酶，可通過多種途徑介導細胞凋亡[6]。在腦缺血缺氧模型中p38及JNK通路均被激活[9-10]。研究[11]發現慢性低O2高CO2小鼠海馬神經細胞內JNK表達較正常對照組明顯增加，本研究發現慢性低O2高CO2模型小鼠海馬磷酸化p38 MAPK蛋白表達明顯升高，因此慢性低O2高CO2模型動物海馬中JNK、p38通路均被激活。

caspase-3被稱為細胞凋亡的最終執行者，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，是多種凋亡途徑的共同下游部分[12]。本研究發現慢性低O2高CO2模型小鼠海馬AI較對照組明顯增高，與之前研究結果[5，13]相一致，而且慢性低O2高CO2模型小鼠海馬caspase-3活性也較對照組明顯升高，因此本研究進一步在分子水平證明慢性低O2高CO2模型小鼠海馬存在神經細胞凋亡。

p-p38 MAPK可以通過多種途徑調控細胞凋亡，其中包括激活caspase家族成員[14]，慢性低O2高CO2可引起小鼠海馬細胞凋亡增加，caspase-3活性升高，p-p38 MAPK蛋白表達增強。因此促進p-p38 MAPK蛋白表達進而促進caspase-3活化可能是慢性低O2高CO2模型小鼠海馬細胞凋亡的機制之一。

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