姜黃素衍生物L6H4對2型糖尿病大鼠肝組織的保護作用

董細丹，陳曉湖，繆成鋒，徐菲菲，陳三妹，蔡國平

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015；2.紹興文理學院醫學院 護理系，浙江紹興 312000）

2型糖尿病肝臟病變是2型糖尿病的一大并發癥，臨床上以非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）最為常見，后者發病率在2型糖尿病患者中高達50%，在糖尿病伴肥胖患者中幾乎可達100%[1]。NAFLD的發病機制尚不明確，目前較多學者支持“二次打擊”學說：“第一次打擊”主要為脂肪的肝內蓄積，這個過程同胰島素抵抗密切相關；“第二次打擊”為氧化應激反應，氧化應激產生的活性氧將誘導肝實質炎癥，而各種炎癥介質及細胞因子又將活化肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC），導致肝臟細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成和降解失衡，最終促使肝纖維化發生。研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等極其廣泛的藥理活性，能抑制脂質過氧化及轉化生長因子（transferming grawth factor β1，TGF-β1）表達，從而抑制HSC活化，具有保護肝臟及抗纖維化的作用[2]。本實驗以L6H4治療糖尿病及高脂大鼠，探討L6H4對高脂及高糖引起的肝臟損傷的保護作用及機制，為糖尿病肝臟病變的防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及模型建立 雄性SPF級SD大鼠40只（購于溫州醫科大學實驗動物中心，批準文號：wydw2014-0052），體質量180～220 g，適應性喂養1周后，隨機均分為正常對照組、高脂組、高脂治療組、糖尿病組及糖尿病治療組。正常對照組正常飲食，其余各組高糖高脂喂養，糖尿病組及糖尿病治療組喂養4周后加單次30 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，廈門星隆達化學試劑有限公司產品）誘導2型糖尿病模型，檢測尾靜脈空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平，以FBG＞16.7 mmol/L為造模成功，成模后高脂治療組和糖尿病治療組L6H4+1%羧甲基纖維素鈉（L6H4由溫州醫科大學藥學院梁廣教授惠贈，1%羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma公司）連續灌胃治療8周，其余3組以等劑量1%羧甲基纖維素鈉灌胃。12周末，處死大鼠[3]。

1.2 血生化指標檢測 收集各組大鼠血清，以日立7600全自動生化分析儀檢測血總甘油三脂（total triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）水平以及血谷丙轉氨酶（alanine amino transferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate amino transferase AST）、血漿白蛋白（albumin，ALB）等肝功能指標；微量血糖儀測FBG，放射免疫法（試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司）測空腹胰島素（free blood insulin，FINs）并計算胰島素抵抗指數（blood indexes of insulin resistance homeostasis model assessmentestimated insulin resistance，HOMAIR）。

1.3 HE染色標本制備[4]大鼠處死后分離肝臟，0.9%氯化鈉溶液清洗稱重后，取部分肝組織置于4%中性甲醛溶液中固定，經梯度乙醇脫水，石蠟包埋后，制成厚約3 μm的石蠟切片，行HE染色，中性樹脂固封。在光學顯微鏡下觀察各組肝臟組織的形態結構改變。

1.4 油紅O染色標本制備 肝臟組織經OTC包埋，冰凍切片機（機箱溫度約-20 ℃）制作冰凍切片（厚度約6 μm），置于油紅O染液（油紅0.05 g+異丙醇1 000 mL加熱至95 ℃溶解后過濾）中1 h，水洗，置于Harris蘇木素液中進行核復染約10 s，水洗，用甘油明膠（明膠10 g+蒸餾水60 mL+甘油70 mL+石碳酸0.25 g）封固。

1.5 Masson染色標本制備 石蠟切片常規脫蠟，經蘇木素染色5 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，流水沖洗10 min，置于Masson液（變色酸2R 0.25 g+磷鎢酸0.5 g+冰醋酸0.5 mL+蒸餾水50 mL）中染色5 min，沖洗數秒，1%亮綠液染色1 min（觀察顏色并控制時間），梯度乙醇脫水各1 min，置于石碳酸二甲苯中3 s，二甲苯透明，樹膠封片。光鏡下對染色結果進行判讀，膠原纖維呈藍綠色，肝細胞呈紅色。

1.6 肝組織電鏡標本制備 切取小塊肝組織（大小約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm），2.5%戊二醛4 ℃固定1 h，鋨酸后固定，PBS漂洗，丙酮酸梯度脫水，Epon812包埋機包埋，半薄切片定位，RMC-XL型超薄切片機切片，在H-7500型透射電鏡下觀察肝細胞的超微結構。

1.7 免疫組織化學染色（EnVision二步法） 常規石蠟切片經烤片、二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水，3%過氧化氫液中阻斷、高溫高壓抗原修復后，滴加一抗[抗TGF-β1抗體（武漢博士德生物工程有限公司產品，稀釋濃度1∶150）、抗基質金屬蛋白酶抑制劑2（tissue inhibitor metallo protemase 2，TIMP-2）抗體（美國Santa cruz公司產品，稀釋濃度1∶50）及抗基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體（美國abcam公司產品，稀釋濃度1∶200）]，4 ℃孵育過夜，室溫下復溫5 min，PBS液沖洗5 min后滴加兔二抗，37 ℃烤箱孵育30 min，DAB顯色2 min，蘇木素復染，中性樹膠封固，PBS代替一抗作陰性對照。用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計算5個隨機選擇的顯微鏡領域的光密度（OD）。結果判定：胞漿內含有棕黃色顆粒者為陽性表達。

1.8 統計學處理方法 應用SPSS19.0統計分析軟件進行統計分析。計量資料數據為正態分布，結果均用 ±s表示。組間差異用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD法檢驗，方差不齊用秩和檢驗。統計和制圖使用Graph Pad Prism 5軟件。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血生化檢測結果

2.1.1 血糖血脂相關指標：高脂組與糖尿病組大鼠的FBG、FINs、HOMA-IR、TG、TC、LDL-c濃度以及LDL-c/HDL-c值均較正常對照組明顯增高（P＜0.01），糖尿病組大鼠的HDL-c濃度較正常對照組降低（P＜0.01）；高脂治療組與高脂組比、糖尿病治療組與糖尿病組比，FBG、HOMA-IR、TG、TC、LDL-c濃度以及LDL-c/HDL-c值均顯著下降（P＜0.01），糖尿病治療組大鼠與糖尿病組比HDL-c濃度顯著升高（P＜0.01），FINs濃度顯著降低（P＜0.01），見表1。

2.1.2 大鼠血清肝功能指標：與正常對照組比較，高脂組、糖尿病組大鼠血清ATL、AST明顯升高（P＜0.01），ALB水平顯著下降（P＜0.01）；高脂治療組與高脂組比、糖尿病治療組與糖尿病組比，ATL、AST水平明顯降低（P＜0.01），ALB水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

2.2 大鼠肝組織光鏡下形態學改變 正常對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞呈立方形，排列整齊，油紅O染色未見明顯脂滴，Masson染色示僅在門靜脈及匯管區周圍見少量綠色膠原纖維；高脂組肝細胞有明顯脂肪變性，細胞核被擠向一側，伴有炎癥細胞浸潤，肝索結構紊亂，油紅O染色示胞漿內大小不等的橘紅色脂滴，Masson染色未見明顯膠原增生；糖尿病組肝細胞脂肪變性更加明顯，可見氣球樣變，肝索結構破壞，纖維間隔增寬，油紅O染色示胞漿內橘紅色脂滴較高脂組更加密集，Masson染色示粗大的綠色膠原行走于匯管區，肝細胞間亦可見膠原纖維相互連接。高脂治療組、糖尿病治療組大鼠肝臟病變有所減輕，油紅O染色示胞漿內脂滴減少，Masson染色示膠原纖維沉積減輕，纖維間隔變窄。見圖1-3。

表1 各組大鼠血糖血脂相關指標比較（n=8， ±s）

表2 各組ALT、AST及ALB水平比較（n=8， ±s）

2.3 大鼠肝組織透射電鏡下形態學改變 正常對照組大鼠肝細胞核為橢圓形，線粒體為橢圓形，嵴豐富，數量較多，內質網呈層狀排列；高脂組大鼠肝細胞內含大小不等的脂質顆粒，部分融合形成大的脂滴，粗面內質網增多，線粒體腫脹，內室擴張；糖尿病組大鼠肝細胞脂質顆粒數量較高脂組增多，核固縮，染色質加深，線粒體腫脹，嵴排列紊亂、模糊、中斷；L6H4干預后，高脂治療組大鼠肝細胞內脂質顆粒數量減少，線粒體增多，腫脹明顯減輕，板狀嵴清晰，糖尿病治療組核固縮減輕，線粒體增多，見圖4。

2.4 免疫組織化學檢測結果 正常對照組大鼠肝組織中TGF-β1僅在血管周圍少量表達，TIMP-2僅在血管壁和膽管壁少量表達，MMP-2在匯管區少量陽性表達；TGF-β1在高脂組、糖尿病組肝組織的中央靜脈周圍及增厚的纖維間隔內表達明顯增加（P＜0.01），TIMP-2在高脂組肝組織中較正常對照組表達稍增加，在糖尿病組中表達明顯增加（P＜0.01），MMP-2在高脂組及糖尿病組中表達均明顯降低（P＜0.01）；L6H4干預后，高脂治療組與高脂組比、糖尿病治療組與糖尿病組比，TGF-β1及TIMP-2表達量明顯減少（P＜0.01），MMP-2表達量明顯增加（P＜0.01），見表3。

3 討論

圖1 各組大鼠肝組織HE染色觀察（×100）

糖尿病性肝疾病是糖尿病的主要并發癥之一，有20%～30%的患者存在肝內炎癥、纖維組織增生，若無及時的干預，可發展為肝纖維化，最終導致肝功能衰竭[5]。研究發現，高血糖環境是肝臟受損的始動因素，胰島素抵抗使機體對糖利用障礙，大量脂肪被動員，致使游離脂肪酸在肝細胞線粒體內蓄積，并通過多種途徑觸發氧化應激反應和脂質過氧化[6]，此過程不僅可以誘導炎癥介質和細胞因子的釋放，直接損害肝細胞，又可以激活HSC，使其基因表達和表型發生改變，合成ECM增多，釋放細胞因子、膠原酶及其抑制物等，最終導致肝纖維化的發生[7]。

TGF-β1為目前已知最強的致肝纖維化因子，與肝臟纖維化病理分期正相關[8]，由活化的竇內皮細胞及損傷的肝細胞等多種細胞分泌，通過多種信號轉導途徑激活HSC；而活化的HSC可旁分泌活化及自分泌TGF-β1，持續激活HSC，最終導致肝纖維化的形成[9]。此外，TGF-β1還可以促進基質金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor metalloprotemases，TIMPs）表達和或抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達，減少ECM的降解，同時可通過跨膜受體，參與并起始TbRI I-ALK5-Smad2/3信號傳導通路，直接調節膠原蛋白、ECM基因的轉錄及表達，致使ECM生成和降解失衡，進一步加重肝纖維化[10-11]。本實驗發現，高脂組及糖尿病組大鼠TGF-β1表達增多，L6H4治療后，高脂治療組、糖尿病治療組大鼠肝內TGF-β1表達顯著降低，提示L6H4可能通過抑制TGF-β1，抑制HSC活化和分泌ECM，進而減輕肝纖維化。

圖3 各組大鼠肝臟組織Masson染色觀察（×100）

TIMPs/MMPs失衡是導致肝纖維化的一個重要機制[12]，而TIMP-2在肝內表達且對MMPs具有較強的抑制活性[13]，是抗肝纖維化研究的一個熱點。NIE等[14]及HU等[15]分別通過反義核苷酸及合成的特異siRNA靶向抑制TIMP-2基因，發現抑制TIMP-2表達可以顯著減少ECM中I型及IV型膠原的沉積。IV型膠原沉積是肝血竇毛細血管化的關鍵因素，在纖維化早期，以Col IV為主的功能性基底膜破壞，Col IV與LN沉積共同構成連續的基底膜致使肝血竇毛細血管化，影響肝竇血流和肝內外物質交換，加重肝功能損害，是肝纖維化的分子病理學基礎[16]。本實驗發現，L6H4干預后，高脂治療組及糖尿病治療組大鼠肝組織TIMP-2表達顯著下降，MMP-2蛋白表達顯著上升，Masson染色也顯示治療組大鼠肝組織的膠原纖維沉積較高脂組及糖尿病組明顯減少，且TIMP-2的表達變化趨勢同TGF-β1一致。CHENG等[17]體外實驗研究發現姜黃素可抑制HSC的增殖活化，提高MMP-2、MMP-9等的活性，抑制TGF-β1表達，結合本研究發現提示L6H4可能通過抑制TGF-β1表達，直接或通過抑制HSC的活化，下調TIMP-2，減少對MMP-2等MMPs的抑制作用來抑制高脂及糖尿病大鼠肝的纖維化。

臨床和動物實驗證明，姜黃素有明顯降脂、降血糖的藥理作用[18]。本研究發現，高脂治療組及糖尿病治療組的血TG、TC、LDL-c水平明顯下降，糖尿病治療組HDL-c明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），高脂治療組HDL-c稍有上升，但差異無統計學意義（P＞0.05），可能與姜黃素上調載脂蛋白A1和膽固醇流出調節蛋白，促進HDL的合成，同時上調肝內的清道夫受體B I，增加肝細胞對HDL的選擇性攝取[19]相關。脂肪組織是胰島素抵抗的源頭，其慢性炎癥產生的一些炎癥因子將影響到胰島素作用通路促使胰島素抵抗，導致高血糖和高脂血癥，而后兩者則進一步刺激胰島，增加胰島素分泌導致高胰島素血癥，本實驗示L6H4可明顯下調高脂組及糖尿病組大鼠FBG、HOMA-IR水平，并明顯下調糖尿病組FINs水平，這可能同L6H4下調血糖及血脂，減少對胰島刺激有關。此外本實驗發現L6H4可明顯改善模型組大鼠的肝功能及肝組織炎癥、變性壞死等病理改變，同王玲等[20]以姜黃素衍生物B06治療聯合高糖高脂喂養與STZ誘導的2型糖尿病大鼠研究結果一致。

圖4 各組大鼠肝細胞透射電鏡觀察（×10 000）

表3 各組大鼠肝組織TGF-β1、TIMP-2和MMP-2的表達比較（n=8， ±s）

綜上所述，L6H4能調節2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗及糖脂代謝，對高脂及糖尿病大鼠的肝臟具有保護作用，能明顯減輕2型糖尿病大鼠肝臟纖維化，抑制TGF-β1及TIMP-2的表達，上調MMP-2的表達可能是其主要作用機制之一。

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