樹脂改性玻璃離子Vitrebond的光固化時間對細胞毒性的影響

杜若茜，周巧珍，楊征宇，麻健豐

（溫州醫科大學口腔醫學院附屬口腔醫院 修復科，浙江 溫州 325027）

樹脂改性玻璃離子在口腔科廣泛用于充填、粘結及窩溝封閉等。Vitrebond（美國3M公司）為其中一種，它既保持了傳統型玻璃離子的優點，同時還具有樹脂粘接強度高、表面特性及美學性能好等特點[1]。但是，很多與其他玻璃離子材料的比較研究顯示Vitrebond有細胞毒性[2-4]，甚至在ISO 7405：2008《牙科醫學醫療器械在牙科醫學應用中生物相容性的評估》中被選作陽性對照。固化時間過長或者過短，在樹脂聚合時會導致單體轉化的不完全，釋放寬頻譜的殘留化合物[2]。根據以上綜合因素，本研究選擇樹脂改性玻璃離子Vitrebond作為實驗對象，研究不同光固化時間對其細胞毒性的影響，為臨床應用提供實驗基礎和理論依據；同時比較瓊脂擴散法和MTT法的敏感度，以供其他學者進行相關研究時參考。

1 材料和方法

1.1 材料 L929成纖維細胞（CCL 1，美國標準菌庫），青霉素G（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、兩性霉素B（0.25 μg/mL）、MEM鹽溶液、左旋谷氨酰胺、碳酸氫鈉、中性紅試劑、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），棉籽油（比利時Acros Organics公司），6%牛胎兒血清（美國Hyclone Laboratories公司），Vitrebond（美國3M公司）。

1.2 設備 光固化燈1 000 mw/cm2（美國3M公司），輻射表（美國Demetron/Kerr公司），自動化細胞計數器（美國Invitrogen公司），6孔細胞培養板（美國BD公司），96孔細胞培養板（美國Corning Costar公司），無菌濾片（d=6 mm，美國Millipore公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），分光光度計（美國Bio-Rad公司）。

1.3 樣本制備和分組方法 對照組樣本制備和分組：將MEM和棉花籽油（CS Oil）分別作為極性和非極性萃取液，苯酚作為陽性對照，MEM、CS Oil作為陰性對照。實驗組樣本制備和分組：選用美國3M公司提供的產品Vitrebond，根據說明書以粉液比1.4∶1分別制成2 mm厚，直徑為5 mm圓柱形樣本。分為4個組，每組樣本8個，共計32個樣本，在1 000 mw/cm2（3 M/ESPE Elipar Freelight）的光固化強度下（具體時間見表1），將樣本稱重，加入0.2 g/mL MEM或CS Oil。樣本與介質在含5% CO2細胞培養箱中37 ℃保存72 h。

表1 實驗分組（n=8）

1.4 細胞培養方法 選用L929成纖維細胞進行體外細胞培養技術培養，6%完全培養基培養，當細胞密度達到1.0×105cell/mL時，用Hank’s平衡鹽溶液（HBSS）清洗，0.05% 胰蛋白酶/0.5 mmol/L EDTA處理，在6孔細胞培養板各孔中加入細胞混懸液，在含5% CO2細胞培養箱中37 ℃培養24 h。

1.5 瓊脂擴散實驗方法 準備3%的瓊脂，高壓蒸汽消毒，冷卻至50～60 ℃。等量10%完全培養基（37 ℃水?。┘尤氕傊⒒靹?。細胞中的舊培養液被新鮮的瓊脂、培養基混合物代替?；旌衔锸覝叵履?，加入中性紅溶液并在暗室中保持15 min，然后去除多余的中性紅溶液。制備樣本將光照面置于瓊脂中心；帶有萃取液的濾紙也置于瓊脂中心；帶有苯酚的濾紙作為陽性對照，帶有MEM、棉花籽油的濾紙作為陰性對照。將6孔細胞培養板置于含5%CO2，37 ℃細胞培養箱中。細胞毒性描述分別為無毒性（指數為0）、輕微毒性（指數為1）、中度毒性（指數為2-3）、嚴重毒性（指數為4-5）。24、48 h分別評估細胞脫色距離和細胞溶解指數。細胞脫色距離=（脫色區直徑-樣本直徑）/2；細胞脫色指數分別為0（無脫色）、1（脫色僅限于樣本下方）、2（脫色距樣本＜5 mm）、3（脫色距樣本5～10 mm）、4（脫色距樣本＞10 mm）、5（完全脫色）。細胞溶解比例在顯微鏡下計數。細胞溶解指數分別為0（無細胞溶解）、1（＜20%細胞溶解）、2（20%～40%細胞溶解）、3（40%～60%細胞溶解）、4（60%～80%細胞溶解）、5（＞80%細胞溶解）。

1.6 MTT實驗方法 第1天實驗組樣本分別在1 000 mw/cm2光照強度下光照15、30、45、0 s。1 h以后加入6%完全培養液（0.2 g/mL）作為萃取中介。樣本和中介在含5% CO2，37 ℃細胞培養箱中放置72 h。第2天L929細胞用HBSS清洗，0.05%胰蛋白酶/0.5 mmol EDTA處理，調整其細胞密度為5.0×104cell/mL。細胞混懸液加入96孔細胞培養板，在含5% CO2細胞培養箱中37 ℃培養48 h。第4天樣本萃取液根據ISO7505生物材料的細胞毒性體外實驗檢測法稀釋至E1=1∶1，E2=1∶2，E3=1∶4，E4=1∶8，E5=1∶16，E6=1∶32。96孔細胞培養板中的舊培養液被樣本的萃取稀釋液代替，包括空白對照、陽性對照和陰性對照，每個樣本6個孔。第5天吸出培養液，停止細胞生長，立即用MTT實驗測試細胞活性。每孔中加入100 μL MTT液體，4 h保溫，去除上清液，加入100 μL DMSO。分光光度計570 nm波長下測定光學密度。

1.7 統計學處理方法 采用SPSS11.5統計軟件進行統計分析。實驗1、2、3組間細胞毒性差異分別應用ANOVA及Student-Newman-Keuls（SNK）方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瓊脂擴散實驗檢測Vitrebond細胞毒性 瓊脂擴散實驗瓊脂中培養24和48 h后，陰性對照組及光固化的實驗組未發現細胞毒性（見表2-3），細胞生長良好，未見細胞脫色及溶解。陽性對照組及未光固化組均有很強的細胞毒性，鏡下細胞數量明顯減少，出現較嚴重的細胞溶解（見圖1）。

2.2 MTT實驗Vitrebond檢測細胞毒性 MTT實驗中將萃取液稀釋到1∶32后，無論光照時間多少，3個實驗組均可發現細胞毒性，抑制率組間差異無統計學意義（F=1.452，P＞0.05），見表4。MTT實驗中從鏡下可以觀察，陰性對照組細胞生長情況良好，MTT結晶分布均勻，見圖2a。苯酚陽性對照組及1∶1和1∶2稀釋后呈嚴重的細胞毒性反應，細胞外形消失、崩解，見圖2b-d。將其萃取液稀釋到1∶32，Vitrebond顯示出很強的細胞毒性，僅見少量細胞生長，見圖2e。

表2 24 h后瓊脂擴散實驗Vitrebond細胞毒性

表3 48 h后瓊脂擴散實驗Vitrebond細胞毒性

圖1 瓊脂擴散實驗中L929細胞電鏡下形態（中性紅染色，×20）

表4 MTT 1∶32稀釋不同光照時間下的抑制率（ ±s）

3 討論

樹脂改性玻璃離子和傳統玻璃離子相比，具有抗壓強度高，溶解度小，微滲漏率小，與牙體組織粘結性好等優點[5]。但是樹脂改性玻璃離子的液體成分如甲基丙烯酸羥乙酯（2-hydroxyethyl meth-acrylate，HEMA）被認為具有細胞毒性。樹脂改性玻璃離子在臨床操作中作為粘結劑時，為獲得更好的稠度往往選擇低粉液比，導致HEMA濃度的升高。剩余甲基丙烯酸酯單體破壞細胞膜的脂雙層，從而導致細胞的溶解，產生細胞毒性[6]。ISO 7405：2008（牙科醫學-醫療器械在牙科醫學應用中生物相容性的評估）明確將樹脂改性玻璃離子Vitrebond做為體外實驗的陽性對照，但是，我們在實際進行評估操作時發現，光固化時間對Vitrebond的毒性有所影響，并非不表示該材料完全有毒性。PALMER等[7]報道Vitrebond在光刺激下會引起高濃度的HEMA單體聚合，由此減小細胞毒性。STANISLAWSKI等[8]也發現樹脂改性玻璃離子釋放的單體濃度不足以引起細胞毒性，高濃度Zn2+是唯一可以引起細胞毒性的成分。對于成牙本質細胞（MDPC-23），有研究顯示長固化時間（40 s）比短固化時間（20 s）對細胞活性影響小[9]，或固化時間對細胞活性的影響沒有顯著區別[10]。對于L929成纖維細胞，短固化時間（20 s）引起大多數光固化樹脂粘結劑材料的細胞毒性比長固化時間（40 s）要高[11]。而本實驗研究中發現，在瓊脂中培養24和48 h后，陽性對照組及未光固化組均有很強的細胞毒性，而陰性對照組及進行光固化的實驗組未發現細胞毒性，未經過光照處理的Vitrebond，可發現細胞代謝明顯減少，即細胞毒性的增加。MTT實驗中卻可以發現，無論光固化時間多少，實驗組間均可存在細胞毒性，且抑制率組間無統計學差異。由此可以推測，光固化時間的改變對細胞毒性的影響不大，但經過光固化的Vitrebond比未經光照的毒性有所減少，意味著殘留HEMA濃度隨著光固化時間降低。即樹脂改良玻璃離子的光引發體系中，光線通過修復體已經固化表層所能到達的樹脂內部的深度有限，特別是修復體較厚時，極易導致復合樹脂的聚合不充分[8，12]。本實驗中采取廠商推薦的2 mm深度均發現了細胞毒性，在臨床應用中通過減小每次光照的鋪層厚度，同時延長光照時間是否可以減小細胞毒性，該設想將在后續實驗中進行驗證。

也有體外研究表明，樹脂改性玻璃離子相比在光固化條件且潮濕的環境中，不進行光照固化會釋放更多的殘留HEMA[13]。這些研究都指出樹脂改性玻璃離子在固化反應過程中，在有水介質存在的情況下，若直接接觸牙髓細胞會釋放引起細胞毒性的物質。本實驗研究中Vitrebond在培養細胞上直接應用，使其沒有進一步的防御機制來中和毒性物質對細胞的損傷。由此可以推測在這種類型的實驗中獲得的結果強化了在臨床情況下獲得的預期結果。而臨床上，口腔材料有時候并不直接與細胞接觸，Vitrebond在體內的細胞毒性是否和光固化時間有關需要更多研究來驗證。

圖2 24 h培養后L929細胞顯微鏡下觀察（MTT染色，×40）

用來評估材料生物相容性的方法有很多。本研究采用瓊脂擴散實驗及MTT法來檢測Vitrebond對L929細胞的毒性作用。MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用分光光度計在570 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量[14]。瓊脂擴散試驗為可溶性抗原與相應抗體在含有電解質的半固體凝膠（瓊脂或瓊脂糖）中進行的一種沉淀試驗[15]。通過兩者對比，發現MTT實驗能更敏感地檢測出細胞毒性。瓊脂擴散實驗的結果與MTT實驗結果不符，如果只選用瓊脂擴散實驗就無法發現材料的細胞毒性，可能跟MTT實驗原理有關。因此，大致直觀地評估口腔材料的細胞毒性可以直接采用快速簡便的瓊脂擴散實驗，但若需要更敏感且數據精確的結果，則需采用MTT實驗。

[1] MUSA A, PEARSON G L, GELBIER M. In vitro investigation of fluorideion release from four resin-modified glass polyalkenoate cements[J]. Biomaterials, 1996, 17(10)∶1019-1023.

[2] LOVELL L G, NEWMAN S M, DONALDSON M M, et al.The effect of light intensity on double bond conversion and flexural strength of a model, unfilled dental resin[J]. Dent Mater, 2003, 19(6): 458-465.

[3] SPAHL W, BUDZIKIEWICZ H, GEURTSEN W. Determination of leachable components from four commercial dental composites by gas and liquid chromatography mass spectrometry[J]. J Dent, 1998, 26(2): 137-145.

[4] ASMUSSEN E. Restorative resins: hardness and strength vs. quantity of remaining double bonds[J]. Scand J Dent Res, 1982, 90(6): 484-489.

[5] MITRA S B, LEE C Y, BUI H T, et al. Long-term adhesion and mechanism of bonding of a paste-liquid resin-modified glass-ionomer[J]. Dent Mater, 2009, 25(4): 459-466.

[6] 郭曉偉, 嚴敏, 宮海環, 等. 復合樹脂細胞毒性檢測方法的進展[J]. 口腔醫學, 2016, 9(36)： 845-848

[7] PALMER G, ANSTICE H M, PEARSON G J. The effect of curing regime on the release of hydroxyethyl methacrylate(HEMA) from resin-modified glass-ionomer cements[J]. J Dent, 1999, 27(4): 303-311.

[8] STANISLAWSKI L, DANIAU X, LAUTI A, et al. Factors responsible for pulp cell cytotoxicity induced by resin-modified glass ionomer cements[J]. J Biomed Mater Res, 1999,48(3): 277-288.

[9] DE SOUZA COSTA C A, HEBLING J, HANKS C T. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative resin composite applied to an immortalized odontoblast-cell line[J]. Oper Dent, 2003, 28(4): 365-370.

[10] ARANHA A M,GIRO E M,SOUZA P P,et al. Effect of curing regime on the cytotoxicity of resin-modified glass-ionomer lining cements applied to an odontoblast-cell line[J].Dent Mater, 2006, 22(9): 864-869.

[11] ERGUN G, EGILMEZ F, YILMAZ S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led[J]. J Appl Oral Sci, 2011, 19(3):286-292.

[12] TRUMPAITE-VANAGIENE R, BUKELSKIENE V, ALEKSEJUNIENE J, et al.Cytotoxicity of commonly used luting cements—An in vitro study[J]. Dent Mater J, 2015, 34(3):294-301.

[13] SALEHI S, GWINNER F, MITCHELL J C, et al. Cytotoxicity of resin composites containing bioactive glass fillers[J].Dent Mater, 2015, 31(2): 195-203.

[14] MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(1-2): 55-63.

[15] YY/T 0127.9-2001口腔材料生物學評價, 第2單元： 口腔材料生物試驗方法, 細胞毒性試驗： 瓊脂覆蓋法及分子濾過法[S].