人DNMT3A基因慢病毒載體構建及其乳腺癌細胞MDA-MB-231穩定表達株的建立

張慧變，王媛，于林

(天津醫科大學，天津300070)

人DNMT3A基因慢病毒載體構建及其乳腺癌細胞MDA-MB-231穩定表達株的建立

張慧變，王媛，于林

(天津醫科大學，天津300070)

目的構建人類DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)蛋白過表達慢病毒載體并建立乳腺癌細胞MDA-MB-231穩定表達株。方法從乳腺癌細胞MDA-MB-231中提取總RNA，逆轉錄出含DNMT3A的cDNA；以DNMT3A的cDNA為模板，根據其CDS序列設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶位點的引物序列，采用PCR法擴增出帶有雙酶切位點的目的基因；采用雙酶切法將目的片段連接到到慢病毒表達質粒pLVX-IRES-Hyg中，獲得重組的pLVX-FLAG-DNMT3A表達載體。重組的pLVX-FLAG-DNMT3A表達載體通過與包裝質粒共轉染293T細胞，獲得攜帶FLAG-DNMT3A的重組慢病毒。以慢病毒感染MDA-MB-231細胞，48 h后在培養基中加入1 μg/μL的嘌呤霉素，篩選出穩定表達DNMT3A蛋白的細胞株，檢測穩定株及野生型細胞DNMT3A蛋白及mRNA表達水平。結果構建的重組質粒經菌落PCR、重組質粒雙酶切、質粒PCR驗證及測序比對鑒定正確。用病毒感染MDA-MB-231細胞，藥物篩選后獲得的過表達穩定株中，DNMT3A蛋白及mRNA表達水平分別為13.2±0.48、107.10±0.46，均高于野生型及空載對照。結論成功構建了DNMT3A基因慢病毒表達載體pLVX-FLAG-DNMT3A，并在MDA-MB-231細胞中篩選出穩定表達DNMT3A的細胞株，為進一步探討DNMT3A在乳腺癌中的作用提供了體外細胞系模型。

DNMT3A基因；慢病毒載體；MDA-MB-231細胞；乳腺癌

乳腺癌是全世界女性高發的癌癥之一，嚴重危害女性健康[1]。研究表明，表觀遺傳學調控異常在乳腺癌的發生發展中起重要作用。表觀遺傳學調控能夠動態改變染色質的構象，進一步影響基因轉錄或失活[2]。在腫瘤的發生發展過程中，DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的重要方式之一[3]，而DNA甲基轉移酶(DNMT)作為調控甲基化的關鍵酶，在乳腺癌的發生發展中起關鍵作用。在哺乳動物中，具有催化活性的DNAT主要有4種，分別為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L[4]。DNMT3A是DNMT家族中重要成員之一，在從頭合成甲基化中發揮關鍵作用[5]。最新研究表明，DNMT3A及其調控基因異常表達在促進乳腺癌發生發展中具有重要作用。2017年2～7月，我們通過構建DNMT3A慢病毒表達載體，經慢病毒感染并篩選出穩定表達DNMT3A的MDA-MB-231細胞株，為探討DNMT3A在乳腺癌發生、發展及轉移中的作用機制提供體外細胞系模型。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231購于ATCC細胞庫，293T細胞系為本實驗室保存。慢病毒載體質粒pLVX-IRES-Hyg，包裝質粒1和包裝質粒2由天津醫科大學生物化學與分子生物學教研室石磊教授惠贈，圖1為慢病毒載體質粒pLVX-FLAG-DNMT3A圖譜。Trans1-T1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、Trans2KPlusⅡDNA Marker購于北京全式金公司。Ampicillin和SYBRGreen購自羅氏公司，轉染試劑Polyethyleneimine及鼠源FLAGM2抗體購自Sigma公司。PrimeSTAR?Max DNA Polymerase購于Takara公司。EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司。由蘇州金唯智公司完成所有引物合成和基因測序工作。Puromycin、小量DNA快速回收試劑盒質粒及快速小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。兔源DNMT3A單克隆抗體購于CST公司。辣根過氧化氫酶標抗鼠IgG、兔IgG為美國KPL公司產品。

1.2 重組慢病毒載體pLVX-FLAG-DNMT3A的構建及鑒定 提取MDA-MB-231細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，根據DNMT3A的CDS序列(NM_175629.2)設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶位點及FLAG標簽的引物序列。上游引物5′-CCGGAATTCATGGATTACAAGGATGACGA-CGATAAGATGCCCGCCATGCCCTCC-3′；下游引物5′-CGCGGATCCTTACACACACGCAAAATACTC-3′。

圖1 重組慢病毒表達載體pLVX-FLAG-DNMT3A圖譜

PCR反應體系及條件參照說明書。用1%的瓊脂糖凝膠將PCR產物進行電泳鑒定，切膠回收目的片段。以EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切純化后的PCR產物及本實驗所有的pLVX-IRES-FLAG-SND1質粒，電泳后回收并純化。將線性pLVX-IRES-Hyg質粒載體與具有相同黏性末端的DNMT3A目的片段在T4 DNA連接酶的作用下于25 ℃下連接1 h，連接產物轉化感受態細菌大腸桿菌Trans1-T1，在含有氨芐西林抗性的LB平板上篩選克隆。挑取微量克隆加入到可擴增FLAG-DNMT3A的PCR體系中擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。挑取陽性單克隆搖菌擴大培養并提取重組質粒，用FLAG-DNMT3A引物進行質粒PCR，PCR產物大小為2 805 bp。采用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質粒pLVX-IRES-DNMT3A進行雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小，兩條條帶分子量分別在9 000 bp左右和3 000 bp左右為初步鑒定正確的質粒。將雙酶切鑒定正確的質粒進行DNA測序進一步鑒定插入序列的準確性。

1.3 慢病毒毒粒包裝 293T細胞常規傳代培養，待細胞生長至60%左右，在轉染試劑聚乙烯亞胺介導下，用上述3種重組質粒及空載質粒分別與包裝質粒共轉染293T細胞。48 h后收集培養液上清，4 ℃離心10 min，用0.45 μm的濾器過濾，-80 ℃長期保存用于感染。

1.4 MDA-MB-231細胞的感染及穩定株的篩選與鑒定 按3×105/孔將MDA-MB-231細胞接種于6孔培養板，待細胞生長至60%匯合后，棄上清直接加入2 mL病毒液，補加200 μL FBS和20 μg聚凝胺。感染病毒24 h后更換新鮮的L-15培養基，48 h后加入嘌呤霉素1 μg/mL進行抗藥篩選。篩選出能夠穩定表達FLAG-DNMT3A的MDA-MB-231穩定株，用TRIzol法提取MDA-MB-231野生型細胞及穩定株的總RNA，每份樣品取2.5 μg逆轉錄為cDNA。采用定量PCR法檢測DNMT3A mRNA表達，以GAPDH為內參。用RIPA緩沖液提取MDA-MB-231野生型細胞及穩定株的總蛋白，經BCA法檢測總蛋白濃度后取15 μg，以β-actin為內參，用Western blotting法檢測DNMT3A蛋白表達。

2 結果

2.1 重組慢病毒質粒pLVX-FLAG-DNMT3A的鑒定與測序 電泳結果顯示，挑取的14個陽性克隆中，除10號以外，其余PCR產物的條帶均在3 000 bp左右，證明除10號以外其余均轉化成功(圖1)。選取條帶較亮且位置正確的1、2、3號菌液提取質粒，進行雙酶切及質粒PCR，電泳結果顯示，雙酶切后得到兩個條帶分別為9 000 bp和3 000 bp左右(圖2)，質粒PCR產物的條帶均在3 000 bp左右(圖3)，初步鑒定質粒正確。選取1、2、3號菌液進行基因測序，測序結果與目的序列完全一致，證明FLAG-DNMT3A已成功插入到pLVX-IRES-Hyg載體。

注：M為DNA Marker；1～14號為陽性克隆菌落PCR產物；+為以cDNA為模板擴增目的片段作為陽性對照；-為以細菌培養基為模板擴增PCR產物作為陰性對照。

圖1重組質粒菌落PCR鑒定圖

注：M為DNA Marker；VEC為pLVX-IRES-Hyg載體；1、2、3為1號、2號、3號陽性克隆菌落提取的環狀pLVX-FLAG-DNMT3A重組質粒；-為酶切前質粒；+為質粒經EcoR1和BamH1雙酶切后產物。

圖2重組質粒EcoR1和BamH1雙酶切鑒定圖

注：M為DNA Marker；1、2、3為pLVX-FLAG-DNMT3A重組質粒PCR產物。

圖3重組質粒PCR鑒定圖

2.2 MDA-MB-231細胞慢病毒穩定株的篩選與鑒定結果 以野生型MDA-MB-231細胞作為空白對照，其DNMT3A蛋白和mRNA表達量設為1，質粒空載對照及過表達穩定株中DNMT3A蛋白的相對表達量分別為2.16±0.67、13.2±0.48，DNMT3A mRNA的相對表達量分別為2.05±0.34、107.10±0.46，DNMT3A慢病毒穩定株蛋白及mRNA的相對表達量較野生型及空載對照均增加(P均<0.01)，證明穩定表達DNMT3A蛋白的MDA-MB-231慢病毒穩定株構建成功。

3 討論

表觀遺傳學是研究除DNA序列變化以外的其他機制引起的基因表達和細胞表型的可遺傳的改變[6]。表觀遺傳學調控真核基因的表達，與人類重大疾病密切相關，一直以來都是生命科學領域研究的熱點。表觀遺傳學現象涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑及非編碼RNA的調控。DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要標志[7]，在細胞分化、腫瘤發生發展中起著關鍵作用，DNA甲基轉移酶負責將甲基基團添加到CpG二核苷酸，DNMT3A作為一種從頭合成DNA甲基轉移酶在調控DNA甲基化中有著重要作用[8]。DNMT3A位于染色體2p23，由34個外顯子編碼的長130 kDa蛋白質，總體來說其包含兩個結構域：N端調節區和C端催化區，N端調節區又包括一個保守的PWWP結果域及富含半胱氨酸的ADD結構域[9]，最新研究表明PWWP結構域可以與H3K36me3直接結合，ADD結果域通過與一些轉錄因子及表觀遺傳學調節因子相結合，如PU.1、Myc、p53、RP58、HDAC1、HP1、EZH2、SUV39H1[10]，進而影響一些特定位點DNA的甲基化。

在腫瘤中，全基因組的甲基化模式發生了改變[7]，在一些特殊基因的啟動子區域常常伴隨著CpG島的高甲基化及非CpG島的低甲基化[11]，這些改變如何產生及其在腫瘤發生發展中的作用尚不明確。最新研究表明，DNMT3A在多種腫瘤細胞中高表達，然而DNMT3A促進腫瘤形成的機制尚不明確。有一種假說認為，DNMT3A升高導致一些重要的腫瘤抑制基因沉默[10]。在乳腺癌中，E-cadherin啟動子區域高甲基化使其表達抑制[12]，促進腫瘤細胞的上皮間質化轉變[13]，進而促進腫瘤細胞的侵襲與轉移。此外有文獻報道，乳腺癌組織DNMT3a的表達量增加[14]，提示DNMT3a能促進乳腺癌的發生。因此研究DNMT3A參與乳腺癌發生和轉移的機制顯得尤為重要。

慢病毒載體介導的基因轉移相對于真核表達質粒來說具有高病毒滴度、高轉染效率及更好的穩定性等優勢[15]。三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系來源于發生乳腺癌轉移患者的胸腔積液，具有高轉移及侵襲能力[16]，是研究乳腺癌很好的細胞模型。但是由于其轉染效率不高，使用慢病毒載體能夠高效地將外源目的基因穩定整合入宿主細胞的基因組中，從而實現目的基因持久穩定性表達的目的。本實驗將FLAG-DNMT3A基因插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-Hyg，構建重組慢病毒載體pLVX-FLAG-DNMT3A，在293T細胞中進行慢病毒包裝。用包裝好的慢病毒顆粒感染MDA-MB-231細胞，經過藥物抗性篩選，建立MDA-MB-231慢病毒穩定株。DNMT3A穩定表達的MDA-MB-231細胞株的獲得，為從細胞與分子水平上探討DNMT3A對乳腺癌細胞的調控作用及機制提供了很好的體外細胞系模型，為進一步研究乳腺癌的發生發展及轉移機制奠定了基礎，并為乳腺癌的治療提供了新的分子靶標。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] Tan EJ, Kahata K, Idas O, et al. The high mobility group A2 protein epigenetically silences the Cdh1 gene during epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(1): 162-178.

[3] Li E, Zhang Y. DNA methylation in mammals[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014,6(5):a019133.

[4] Chédin F. The DNMT3 family of mammalian de novo DNA methyltransferases[J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2011,101:255-285.

[5] Cedar H, Bergman Y. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms[J]. Nat Rev Geneti, 2009,10(5):295-304.

[6] Jones PA, Baylin SB. The epigenomics of cancer[J]. Cell, 2007,128(4):683-692.

[7] Spencer DH, Russler-Germain DA, Ketkar S, et al. CpG island hypermethylation mediated by DNMT3A is a consequence of AML progression[J]. Cell,2017,168(5):801-816.

[8] Oka M, Rodic N, Graddy J, et al. CpG sites preferentially methylated by dnmt3ain vivo[J]. J Biol Chem, 2006,281(15):9901-9908.

[9] Zhao Q, Rank G, Tan YT, et al. PRMT5-mediated methylation of histone H4R3 recruits DNMT3A, coupling histone and DNA methylation in gene silencing[J]. Nat struct Mol Biol, 2009,16(3):304-311.

[10] Chen BF, Chan WY. The de novo DNA methyltransferase DNMT3A in development and cancer[J]. Epigenetics, 2014,9(5):669-677.

[11] De Carvalho Daniel D, Sharma S, You Jueng S, et al. DNA methylation screening identifies driver epigenetic events of cancer cell survival[J]. Cancer Cell, 2012,21(5):655-667.

[12] Liu YN, Lee WW, Wang CY, et al. Regulatory mechanisms controlling human E-cadherin gene expression[J]. Oncogene, 2005,24(56):8277-8290.

[13] Lombaerts M, van Wezel T, Philippo K, et al. E-cadherin transcriptional downregulation by promoter methylation but not mutation is related to epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer cell lines[J]. Br J Cancer, 2006,94(5):661-671.

[14] Roll JD, Rivenbark AG, Jones WD, et al. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines[J]. Mol Cancer, 2008,7:15.

[15] Mátrai J, Chuah MKL, VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications[J]. Mol Ther, 2010,18(5):477-490.

[16] Kang Y, Siegel PM, Shu W, et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone[J]. Cancer Cell, 2003,3(6):537-549.

ConstructionofhumanDNMT3AlentiviralvectorandestablishmentofstaleMDA-MB-231cellline

ZHANG Huibian,WANG Yuan, YU Lin

(Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China)

ObjectiveTo construct the lentiviral vector of human DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) and to establish the stable breast caner MDA-MB-231 cell line.MethodsThe total RNA was extracted from MDA-MB-231 cells and cDNA containing DNMT3A was inverse transcribed. DNMT3A fragment containing EcoRⅠand BamHⅠsites was amplified by PCR and was inserted into pLVX-IRES-Hyg lentiviral vector. Then the recombinant expression vector pLVX-FLAG-DNMT3A was co-transfected into 293T cell line with packaging plasmids, and the culture supermatant containing the lentiviral particles was collected to infect MDA-MB-231 cells. After 48 h, 1 μg/μ puromycin was used to screen the infected cells, so as to obtain a cell line with stable expression. The protein and mRNA expression levels of DNMT3A were detected by Western blotting and PCR.ResultsBacteria colonies PCR, double restriction enzyme digestion, plasmid PCR identification, and DNA sequencing demonstrated the lentiviral vector pLVX-FLAG-DNMT3A was constructed. MDA-MB-231 cells were infected by the lentivirus, and the protein and mRNA expression of DNMT3A was significantly up-regulated following screening with puromycin.ConclusionsThe DNMT3A gene lentiviral vector pLVX-FLAG-DNMT3A is constructed successfully. The cell line stably expressing DNMT3A is screened in MDA-MB-231 cells, which provides an in vitro model for further study of molecular function and mechanism of DNMT3A in human breast cancer.

DNMT3A gene; lentiviral vector; MDA-MB-231 cells; breast carcinoma

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.002

Q591.2;Q784

A

1002-266X(2017)42-0005-04

國家自然科學基金資助項目(81672592，81202102)。

張慧變(1991-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤分子生物學。E-mail: 13821860893@163.com

于林(1983-)，男，副教授，主要研究方向為腫瘤轉移相關分子生物學。E-mail: onoblivion@tmu.edu.cn

2017-07-27)