結直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達及意義

李建楓，徐衍全，程輝，孫洋

(三亞市人民醫院，海南三亞572000)

結直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達及意義

李建楓，徐衍全，程輝，孫洋

(三亞市人民醫院，海南三亞572000)

目的觀察結直腸癌組織中miR-31、程序性細胞死亡因子4(PDCD4)的表達情況，分析其與結直腸癌發生發展的關系。方法選擇80例結直腸癌患者，收集其臨床資料(包括性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結是否轉移等)。取患者手術切除的癌組織和癌旁組織，采用RT-PCR法檢測miR-31、PDCD4 mRNA表達，分析miR-31、PDCD4 mRNA表達與臨床病理特征的相關性，采用簡單相關分析法分析癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達的相關性。結果癌組織中miR-31相對表達量高于癌旁組織，PDCD4 mRNA相對表達量低于癌旁組織(P均<0.05)。癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達與TNM分期、分化程度及淋巴結是否轉移有關(P均<0.05)，與癌癥部位、性別、年齡、腫瘤直徑無關(P均>0.05)。相關性分析顯示，癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達呈負相關(r=-0.412，P<0.05)。結論結直腸癌組織中miR-31表達升高、PDCD4 mRNA表達降低，二者異常表達與結直腸癌病情進展及惡化轉移有關。

結直腸癌；微小RNA-31；程序性細胞死亡因子4

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。近年來，由于人口老齡化及居民生活方式和飲食習慣的改變等多種因素的影響，我國結直腸癌發病率呈逐年上升趨勢，且發病人群呈年輕化趨勢[1]。目前對于結直腸癌的治療手段主要以手術切除為主、放化療為輔，但治療效果并不理想。因此尋找與結直腸癌發生發展有關的分子標志物，對于疾病早期干預和治療具有重要價值。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于真核細胞內的一類小型內源性非編碼RNA調控因子，在細胞分化、細胞周期和凋亡的調控中發揮重要作用。近年研究發現，多種miRNA的表達異常與腫瘤的發生、發展及預后有關[2]，miR-31與結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤關系的研究也受到廣泛關注。程序性細胞死亡因子4(PDCD4)是一種新發現的細胞凋亡基因，可抑制蛋白轉錄及翻譯，調控細胞程序性死亡，從而發揮抑制腫瘤細胞生長的作用。研究發現，PDCD4在多種惡性腫瘤中均呈現不同程度的表達降低或缺失，并可作為抗腫瘤的治療靶點[3]。本研究通過觀察結直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA的表達變化及其與結直腸癌發生發展的相關性，旨在為結直腸癌的診斷、治療及預后評估提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2017年1月在我院行手術治療的80例結直腸癌患者，男49例、女31例，年齡40～81(54.8±9.7)歲。患者均經術后病理檢查確診，結腸癌29例、直腸癌51例。腫瘤直徑≥4 cm 38例，<4 cm 42例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期36例；細胞分化程度高分化31例，中分化26例，低分化23例；合并淋巴結轉移34例，無淋巴結轉移46例?；颊呔鶠槭状卧\斷和治療；術前進行放化療及其他輔助治療；排除其他惡性腫瘤。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過，患者均知情同意。

1.2 臨床資料收集 查閱患者的病歷本，收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結是否轉移等相關臨床資料。

1.3 癌組織及癌旁組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。收集癌組織及癌旁(距離癌組織5 cm以上)正常黏膜組織，液氮速凍后，-80 ℃保存。取大腸組織50～100 mg剪碎，TRIzol法提取總RNA，使用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄生成cDNA，-20 ℃保存備用。采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR法進行cDNA的定量檢測。PCR mix的擴增采用SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(TaKaRa)。miR-31莖環引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTGGAT-ACGACCAG-CTA-3′，miR-31上游引物為5′-ACGCGGCAAGATGCTGGCA-3′，下游引物為5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′；PDCD4 mRNA上游引物為5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3′，PDCD4 mRNA下游引物為5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA -3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環，重復3次。以U6為內參基因記錄各樣本反應管中的熒光信號到達設定閾值時所對應的循環數，即Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-31、PDCD4 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 結直腸癌組織及癌旁組織中miR-31、PDCD4 mRNA的表達差異 癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA的相對表達量分別為8.751±2.161、3.986±1.232，癌旁組織分別為2.011±1.018、7.192±3.915。癌組織中miR-31的相對表達量高于癌旁組織，PDCD4 mRNA的相對表達量低于癌旁組織(P均<0.01)。

2.2 結直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達與TNM分期、分化程度及淋巴結是否轉移有關(P均<0.05)；而與病灶部位、性別、年齡、腫瘤直徑無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達的相關性 癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達呈負相關(r=-0.412，P<0.05)。

3 討論

目前對于結直腸癌的病因及具體發病機制尚不明確，學者普遍認為其與遺傳及飲食因素密切相關，且是一種多基因參與的多階段發展過程。結直腸癌的預后效果不佳，其早期診斷的存活率僅約為60%[4]，淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度、TNM分期等均為影響其預后的重要因素[5，6]。對結直腸癌在發病前進行早期診斷及干預治療對提高療效、改善預后具有重要價值。目前對于結直腸癌的篩選方法主要是結腸鏡檢查和糞便隱血試驗等常規手段，其特異性及敏感性不甚理想。近年來隨著各種分子檢測技術的發展，探尋與結直腸癌發生發展及預后有關的分子標志物成為研究熱點。

表1 結直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

miRNA是一類內源性非編碼單鏈RNA，長度為19～22個核苷酸，在細胞內發揮重要的基因表達調控作用。目前已發現千余種miRNA，其產生過程及生物學功能各有差異。miRNA在細胞內可與其他蛋白質結合生成RNA-誘導沉默復合體，或通過與靶分子mRNA結合，影響mRNA的翻譯及蛋白轉錄過程，從而促進或抑制細胞生長。研究發現，miR-17-92[7]、miR-1914、miR-1915[8]、miR-21、miR-31、miR-145[9]等多種miRNA的異常表達均可能參與結直腸癌等惡性腫瘤的發生發展過程，促進癌癥的侵襲與轉移。王朝杰等[10]報道，結直腸癌的發生發展與miR-31高表達有關，通過特異性抑制HCT-116細胞中miR-31表達可有效抑制細胞的遷移能力。本研究結果顯示，結直腸癌組織中miR-31相對表達量高于癌旁組織，且癌組織中miR-31表達與患者TNM分期、分化程度及淋巴結是否轉移有關。提示結直腸組織中miR-31高表達參與了結直腸癌的發生，并促進癌癥的侵襲與轉移。miRNA在癌癥患者體內發揮作用的機制包括：①與靶向mRNA的3′非編碼區域(3′-UTR)不完全配對，阻斷其翻譯過程，從而下調靶向mRNA表達；②與靶向mRNA的3′-UTR完全配對，使靶基因互補區發生特異性斷裂，從而產生基因沉默而無法表達；③通過加速靶向mRNA的3′端polyA的脫腺苷酸化，使靶向mRNA迅速降解[11]。有研究顯示，miR-31的靶向mRNA可能是PDCD4[12]。

PDCD4是一種抑癌基因，位于人類染色體10q24中，蛋白序列可編碼485個氨基酸。是細胞發生程序性死亡的調控因子，同時還可通過抑制細胞的轉錄、翻譯及多種信號通路而發揮調節腫瘤細胞凋亡的作用。研究顯示，PDCD4在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中均表現為程度不一的減少或缺失，可用于判斷癌癥的惡性程度及患者的生存時間[13，14]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中PDCD4 mRNA相對表達量低于癌旁組織，且癌組織中miR-31表達與患者TNM分期、分化程度及淋巴結是否轉移有關，與文獻[15]報道一致。說明低水平表達的PDCD4可促進結直腸癌的發生及發展進程。其作用機制可能在于：結直腸癌組織中PDCD4通過發生甲基化[15]或與上游基因miR-21結合，導致mRNA發生降解或表達沉默，從而使其對腫瘤細胞凋亡的調控作用受到抑制；PDCD4基因還可通過抑制核轉錄因子AP-1或其表達蛋白與翻譯起始因子eIF4A和eIF4G結合來抑制基因轉錄或翻譯，誘導細胞生長或轉化的抑制[16]。

本研究進一步對癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達的相關性進行分析，結果顯示，二者呈負相關。提示二者可相互作用，共同促進結直腸癌的發生發展。miR-31可能通過靶向結合PDCD4 mRNA的3′-UTR，阻斷其翻譯過程或發生基因沉默，而降低或喪失其對腫瘤細胞的凋亡作用，從而促進腫瘤細胞的生長、分化及轉移。

綜上所述，結直腸癌組織中miR-31及PDCD4 mRNA均異常表達，兩者通過負調節作用，共同參與結直腸癌的發生發展過程，可能成為結直腸癌早期診斷、治療及預后評估的新靶點。對于兩者的具體作用途徑尚待進一步研究。

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