福州地區HBsAg—/HBVDNA+獻血者乙肝病毒S區 MHR變異特征分析

趙亮++周曉真++涂東晉++呂蓉

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.23.010

[摘要] 目的 分析福州地區HBsAg-/HBV DNA+獻血者HBV的基因型及主要親水區（MHR），尤其是其中 “a”決定簇區氨基酸的變異情況，為進一步研究隱匿性乙肝病毒感染的發生機制提供參考。方法 對收集的2013年7月—2014年10月福州地區獻血者的90 874名獻血者血液標本進行HBsAg ELISA與單人份核酸檢測，對篩查出的HBsAg-/HBV DNA+標本，進行HBV DNA的提取和S區基因的擴增和測序。測序結果進行進化分型，分析 MHR中氨基酸序列的變異情況。選取15例前期研究所得的HBsAg+/HBV DNA+標本的測序結果作為對照，比較兩類標本在“a”決定簇區蛋白序列變異上的差異。結果 16份測序結果中B基因型15份，C基因型1份。15例標本中13例在MHR內共發生了33次氨基酸的變異，其中25次集中在“a”決定簇區，HBsAg-/HBV DNA+標該組“a”決定簇區的變異率要高于HBsAg+/HBV DNA+標該組。變異的形式主要為單個的氨基酸的點替換，另有7例標本在124位與125位氨基酸間發生了9個堿基的非移碼插入，造成該位點間“TNR”3個氨基酸的插入。結論 福州地區獻血者HBsAg-/HBV DNA+血液標本中HBV的基因型以B型為主， MHR的氨基酸變異主要集中在 “a”決定簇區，有本地區的地域特點。研究中新發現的3個氨基酸“TNR”的插入變異，可能影響HBsAg的檢出。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；獻血者；基因突變；乙型肝炎表面抗原

[中圖分類號] R446.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）08（b）-0010-05

Analysis of Variation Characteristics of MHR in Region S of HBSAG-/HBVDNA+ among Blood Donors in Fuzhou

ZHAO Liang1， ZHOU Xiao-zhen1， TU Dong-jin1， LYU Rong2

1.Fujian Blood Center， Fuzhou， Fujian Province， 350004 China； 2.Anhui Blood Center， Hefei， Anhui Province， 230071 China

[Abstracts] Objective This paper tries to analyze the HBV genotypes and amino acids variability in major hydrophilic region （MHR）， especially in “a” determinants region， among HBsAg-/HBV DNA+ blood donors in Fuzhou and to provide the reference for the further study of occult hepatitis B virus infection mechanism. Methods Plasma samples of 90 874 cases of blood donors from July 2013 to October 2014 in Fuzhou were screened and tested by HBsAg ELISA and nucleic acid. HBV DNA was extracted and gene of S region was amplified for HBsAg-/HBV DNA+ samples. Evolutionary typing was conducted for sequencing results， and variations of amino acid sequence in MHR were analyzed. 15 cases of HBsAg+/HBV DNA in previous study were selected as the control group， the sequence variations of proteins in “a” determinants region was compared among sub-specimens. Results Among the 16 cases of sequencing results， 15 cases were genotype B and 1 case was genotype C. Among the 15 specimens， a total of 33 variations of amino acids occurred in MHR in 13 specimens， 25 of which concentrated in “a” determinants region. Variation rate in the “a” determinants region of specimens in the group of HBsAg-/HBV DNA+ specimens was higher than that in the group of HBsAg+/HBV DNA+ specimens. The main variation was the point substitution of a single amino acid. In addition， in another 7 specimens， non-frameshift insertions of 9 bases occurred between 124 and 125 amino acids， causing the insertion of three amino acids TNR at this site. Conclusion The genotypes of HBV in specimens of blood donors in Fuzhou were mainly type B， and the variation of MHR mainly concentrated in “a” determinants region， showing regional characteristics of this region. The insertion variation of newly discovered three amino acids TNR may affect the detection of HBsAg.endprint

[Key words] Hepatitis B virus； Blood donors； Gene mutation； Hepatitis B surface antigen

該研究曾對2011年11月—2013年3月福州地區的獻血者血液標本進行過HBsAg和HBV DNA的篩查，發現HBsAg-/HBV DNA+標本檢出率為0.073%[1]。獻血人群主體是健康人群，造成獻血者標本HBsAg-/HBV DNA+的主要原因為窗口期和隱匿型乙型肝炎病毒感染（Occult Hepatitis B virtus Infection，OBI），OBI所占的比例甚至高達90%～95%[2]，對臨床輸血安全造成了威脅。該研究有幸和安徽省血液中心合作，對該地區2013年7月—2014年10月福州地區獻血者的90 874名獻血者血液標本篩查所得的的HBsAg-/HBV DNA+的無償獻血者標本，進行HBV的DNA的提取和S區擴增測序，分析乙型肝炎病毒的基因型和S區的MHR的變異特征，為研究OBI的發生機制提供一個參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

福建省血液中心所采集的該地區獻血者的血液標本，獻血者征詢均符合GB18467-20111《獻血者健康檢查要求》，標本均經過ALT快速法和HBsAg金標試紙初篩合格。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：HBsAg ELISA試劑，單人份核酸聯合檢測及鑒別試劑Procleix Ultrio Assay，所有試劑均批批檢合格，并在效期內使用。主要儀器：Microlab STAR全自動加樣儀，全自動酶免分析儀，Procleix TIGRIS核酸檢測系統。

1.3 檢測方法及判定規則

1.3.1 血清學ELISA檢測HBsAg 標本的HBsAg檢測采用酶聯免疫的兩步法，步驟按試劑說明書要求，結果S/CO值≥0.9判為反應性，<0.9判為非反應性（該中心灰區設為0.9≤S/CO值<1.0）。HBsAg反應性標該次日作雙孔復檢，雙孔中只要有一孔結果為反應性，判為HBsAg（+），否則判為HBsAg（-）。

1.3.2 單人份核酸檢測 該中心采用TMA法單人份核酸檢測（ID-NAT）的模式，核酸檢測與ELISA檢測同步進行，先進行HBV/HCV/HIV核酸的聯檢，檢測反應性的標本再進行HBV/HCV/HIV單項的鑒別試驗，篩出HBV DNA反應性的標本，判為HBV DNA（+）。

1.4 HBsAg-/HBV DNA+標本HBV DNA的提取和S區基因的擴增測序

留取HBsAg-/HBV DNA+標本的血袋血漿進行分裝，-80℃保存，寄送至安徽省血液中心完成HBV DNA的提取和S區基因的擴增，具體反應體系和擴增條件參照發表的文獻[3]。PCR產物由安徽省血液中心寄送上海生工生物工程公司雙向測序，測序結果反饋于該中心做進一步分析。

1.5 HBsAg+/HBV DNA+標本基因序列的獲得

15例HBsAg+/HBV DNA+標本來源于前期研究所收集的無償獻血者標本，標本的HCV抗體、HIV抗體、梅毒螺旋體抗體和ALT均為陰性。HBV DNA的提取、擴增和測序相關試劑和反應條件見參照文獻[1]，所得的DNA序列為全基因組中465～680 bp位置，氨基酸的序列為第108～170位，標本均為B基因型。

1.6 HBV的基因分型

使用 MEGA7.0.18軟件對測序結果進行分析，將HBsAg-/HBV DNA+標本的測序結果與網站https：//hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex 數據庫中各種基因型HBV的標準株進行比對及進化分析。

1.7 MHR氨基酸序列的變異分析

下載相應的基因型的標準株的序列作為參照，用MEGA7.0.18軟件將核苷酸序列轉換為氨基酸序列，將HBsAg-/HBV DNA+組標本和HBsAg+/HBV DNA+組標本的氨基酸序列與標準株進行比對，對HBsAg-/HBV DNA+標本“a”決定簇區和“a”決定簇區以外的MHR的氨基酸變異率作一比較，分析氨基酸變異在MHR的分布情況。將兩組標本“a”決定簇區的氨基酸序列的變異情況作一比較，分析可能存在的影響獻血者HBsAg檢出的氨基酸變異位點。

1.8 統計方法

應用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析，分類計數資料采用 χ2檢驗，P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBsAg-/HBV DNA+標本的檢出情況

90 874名最終檢測出HBsAg-/HBV DNA+標本共68份，檢出率為0.075%。HBsAg（-）/HBV DNA（+）標本的檢出率與該小組2011年11月—2013年3月研究的所得的檢出率（0.073%）相比，差異無統計學意義（χ2=0.025， P﹥0.05）。

2.2 S區基因的測序情況

68份HBsAg-/HBV DNA+標本送寄送至安徽省血液中心進行HBV DNA的提取和S區基因的擴增，最終有15份標本成功完成了測序，其中3份結果采用1#引物用巢式PCR方式擴增得到，產物覆蓋整個S基因區（標本的編號為FJ47-S1、FJ184-S1和 FJ197-S1）；另外13份結果為2#引物采用普通PCR方式擴增得到，產物為部分S基因（標本的編號為FJ66-S4、FJ204-S4、FJ34-S4、FJ39-S4、FJ46-S4、FJ47-S4、FJ71-S4、FJ115-S4、FJ117-S4、FJ199-S4、FJ11-S4、FJ31-S4 和FJ194-S4）。編號為FJ47標本，在2種PCR方法中分別得到了兩個不同的序列，合計得到16個測序結果。endprint

2.3 HBV的序列分析與基因分型

將16份標本的測序結果用MEGA7.0.18軟件與HBV的A-H 基因型各型的標準株進行比對和進化分析，16份標本中除1份為C基因型（FJ194），其余均為B基因型。

2.4 MHR氨基酸變異情況分析

通過與已發表的數據庫中的近源的B型標準株（AB219428與D00331）和C型標準株（GQ358158與GQ924620）的蛋白序列進行比對，16個HBsAg-/HBV DNA+標本的測序結果中除了1份（C型FJ194-S1）在MHR無氨基酸的變異外，其余15份在該區合計發生33次的氨基酸的變異。這33次的變異除了8次發生在“a”決定簇區以外的MHR范圍內（第99～123位和第148～169位氨基酸區），其余的25次變異都集中于“a”決定簇區（第124～147位氨基酸區）。HBsAg-/HBV DNA+標本在“a”決定簇區的氨基酸變異率（6.51%）要明顯高于MHR的其他區域（2.08%）（χ2=25.972，P<0.05）。HBsAg+/HBV DNA+組的標本在第108～170位氨基酸合計發生了12次氨基酸的變異，均為單個氨基酸的替換，變異也集中于“a”決定簇區（9/12），其 “a”決定簇區的氨基酸的變異率（2.50%）要低于HBsAg-/HBV DNA+組的標本（χ2=11.985，P<0.05）。HBsAg-/HBV DNA+ 組標本“a”決定簇區氨基酸的變異類型主要有兩類，一類為堿基的點突變引起的單個氨基酸的替代（18/26），另一類為由9個堿基（ACAAACCGC）的非移碼插入所引起的3個氨基酸TNR插入（8/26），共有7例標本發生此類變異。而HBsAg+/HBV DNA+組標本的氨基酸的變異均為堿基的點突變引起的單個氨基酸的替代，根據氨基酸親水性和疏水性的分類標準，從電荷的改變對“a”決定簇區氨基酸的變異情況作進一步的分析，結果見表1。

3 討論

該研究通過與既往研究的縱向比較，發現福州地區獻血者HBV窗口期感染與OBI的情況比較穩定。68份HBsAg-/HBV DNA+標本S區基因擴增的成功率僅為23.5%，推測與窗口期感染和OBI的病毒載量低有關[4-5]相關學者[7]研究發現OBI的病毒株可通過輸血傳播[6]，胡莉萍等學者也發現隱匿性乙型肝炎可通過家庭成員間的密切接觸傳播。 該研究檢出的HBsAg-/HBV DNA+標本除1例為C基因型，其余均為B型，與我國HBV流行南方多B型，北方多C型的地域特點一致，提示引起OBI的病毒株與野毒株可能有相同的傳播途徑。

HBsAg-/HBV DNA+標本血清學檢測陰性的可能原因中，S基因區突變所引起的HBsAg合成分泌障礙以及MHR，特別是“a”決定簇的抗原表位改變是目前OBI發生機制研究最多的方面。目前國內關于“a”決定簇的研究所報道的以單個氨基酸點替換多見，連續多個氨基酸的插入變異較少見。早期侯金林等[8]學者曾發現3例HBsAg陰性的感染者S區第123～124位氨基酸間出現2～3個氨基酸的插入。后來陳建宏等學者也在1例HBsAg陰性的感染者的標本中檢出了S區第126～126位氨基酸間“RPCMNCTI”插入變異[9]。該研究在HBsAg-/HBV DNA+的獻血者標本新發現了第124～125位氨基酸間3個氨基酸“TNR”的插入變異，該變異出現在8例獻血者的標本中，其中1例（FJ47-S4）同時還發生了C124R的氨基酸替換?！癮”決定簇區富含半胱氨酸，并借助124與137、139與147位半胱氨酸間的二硫鍵形成雙袢結構，維持HBsAg的抗原性。第124位半胱氨酸的替換及其相鄰位點的插入變異，極大可能會影響二硫鍵的形成，造成HBsAg關鍵表位的構形改變，引起OBI。

該研究中HBsAg-/HBV DNA+的獻血者標本乙肝病毒MHR的氨基酸變異主要集中在“a”決定簇，考慮到發生變異標本均為B基因型，故選取該小組前期研究所得的15份B基因型HBsAg+/HBV DNA+獻血者標本所測得的“a”決定簇氨基酸序列作為野毒株對照。HBV復制有逆轉錄的過程，故錯配率高，易發生基因的突變，該研究中二組的標本在相對保守的“a”決定簇都發現有氨基酸的變異，顯示出病毒在“a”決定簇在人群中的多態性。HBsAg-/HBV DNA+標本在“a”決定簇的氨基酸變異要高于HBsAg+/HBV DNA+標本。有學者通過對HBV單克隆載體的構建與表型的分析發現，S區T131N和M133T的變異可能造成HBsAg無法抗體識別[9]。王淏等[10]在對廣州地區的獻血者HBsAg-/HBV DNA+標本MHR的研究中發現T126和Q129出現氨基酸的高頻點置換，推測可能是引起OBI的高突變位點。但該研究發現T126A、Q129R、T131N和M133T在HBsAg+/HBV DNA+組的標本均有出現，其中，T126A、T131N和M133T同時出現HBsAg-/HBV DNA+組和HBsAg+/HBV DNA+組的標本中，提示此類變異有可能對HBsAg+的檢出的影響有限。研究中其他的氨基酸的變異與國內同類研究所發現的變異鮮少有重合[4-5，8-11]。該小組曾對2011年11月—2013年3月福州地區無償獻血者的HBsAg-/HBV DNA+標本的“a”決定簇的氨基酸變異作過研究，發現P127T、T131N、M133T出現次數較多，該次研究也發現同樣的情況，加上出現高頻次的第124～125位氨基酸間出相同的插入變異，提示本地區的HBsAg-/HBV DNA+獻血者中MHR氨基酸的變異情況有自身的地域特點。

為了更好的了解氨基酸的點替換對“a”決定簇表位的影響，該研究分析了替換前后氨基酸的類型，發現HBsAg+/HBV DNA+標該組大部分的點替換氨基酸的極性未發生變化（5/9），包括前面提到的T131N和M133T。HBsAg-/HBV DNA+組與HBsAg+/HBV DNA+組標本未對上的10處點替換中，大部分則發生了氨基酸極性的變化（6/10），這其中很可能包含有引起HBsAg檢出陰性的關鍵變異點，對進一步研究OBI的發生機制提供參考。endprint

現階段隱匿性乙型肝炎病毒感染發生機制的研究中，涉及到OBI標本的判定方面有幾點值的關注。①OBI的定義源自2008年歐洲肝病協會，指感染者肝臟中檢出HBV DNA，血清血漿中檢出或者不能檢出HBV DNA，且HBsAg檢測陰性。因肝組織標本的在臨床上的獲得不易，研究者更多的采用血清及血漿的標本，研究標本的選取上偏向于血漿或血清能檢出HBV DNA標本；②在標本HBsAg的血清學檢測項目上，隨著新的檢測技術和靈敏度更高的試劑出現，早期研究中HBsAg陰性的標本有可能在現階段是判為HBsAg陽性的標本；③同一時期不同品牌的HBsAg檢測試劑盒由于生產工藝的差異以及所選用的包被抗體類型的不同，有的為單克隆抗體，有的為多克隆抗體，對不同變異的HBsAg的檢出能力也存在差異。國外已有學者同時對多個不同廠家的HBsAg檢測能力作了比較證實了該點[12]。④HBV復制擴增的過程中存在逆轉錄，堿基的錯配率高，易變異，因此感染的個體上看，OBI宿主體內的乙肝病毒是以準種的狀態感染，同時期有可能體內共存有不同的HBV變異株，不同的變異株在選擇壓力下，在宿主的整個病毒群體中所占的比例處于一個相對平衡的狀態。陳建宏等[9]對1例OBI患者不同時期留取的4份血液標本所得到的乙肝病毒構建載體進行基因表型的分析，發現患者的病情變化是由多種S基因突變的病毒株引起的。因此，研究中所得到的HBV DNA的基因序列有可能并不能完全的代表OBI患者體內HBV的基因變異情況。這也就能解釋該研中FJ47這例標本為何在二種PCR方法中分別測得了氨基酸變異情況完全不同的二個基因序列。

綜上所述，OBI的發生機制相當復雜，研究中針對MHR的氨基酸的變異就有諸多的報道，該研究對福州地區獻血者的HBsAg-/HBV DNA+標本MHR中，特別“a”決定簇區氨基酸變異研究，所發現的一些新的變異點，對研究該地區的OBI的流行情況和發生機制具有一定的參考意義。

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（收稿日期：2017-05-13）endprint