慢病毒介導(dǎo)SIRT1基因表達降低的ATDC5細胞模型建立*

于斐 曾暉翁鑒 林健靜 解笑宸 孫軍營 肖德明

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳518036）

慢病毒介導(dǎo)SIRT1基因表達降低的ATDC5細胞模型建立*

于斐 曾暉**翁鑒 林健靜 解笑宸 孫軍營 肖德明

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳518036）

背景：沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因是一個與衰老關(guān)系密切的基因，可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT、NF-κB等信號通路影響到組織及機體的衰老過程，并參與骨科相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。建立慢病毒介導(dǎo)的SIRT1基因表達降低的ATDC5細胞模型，可以為研究SIRT1基因相關(guān)的骨科系統(tǒng)疾病如骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等提供實驗基礎(chǔ)。目的：構(gòu)建攜帶小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒載體，將其轉(zhuǎn)染ATDC5細胞系，建立SIRT1基因表達降低的ATDC5細胞模型。方法：根據(jù)RNAi序列設(shè)計原則設(shè)計并合成SIRT1基因的RNAi靶點序列，連接GV248（框架結(jié)構(gòu)：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）載體，轉(zhuǎn)化后經(jīng)陽性克隆測序及PCR鑒定，質(zhì)粒抽提后導(dǎo)入293T細胞，包裝慢病毒，取上清檢測滴度。將含有小鼠SIRT1基因RNAi的病毒顆粒轉(zhuǎn)染ATDC5細胞系，并于熒光顯微鏡下進行觀察，行RT-PCR檢測ATDC5細胞中SIRT1 mRNA的表達情況。結(jié)果：經(jīng)測序、PCR檢測可知，SIRT1基因的RNAi靶點序列與GV248載體連接成功，并包裝成高滴度的慢病毒。攜帶小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒感染ATDC5細胞后，熒光顯微鏡下觀察顯示感染率較高，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶SIRT1基因的慢病毒感染組SIRT1基因mRNA的相對表達量為0.386±0.117，與陰性對照病毒感染組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），敲減效率為61.4%。結(jié)論：成功建立SIRT1基因表達降低的ATDC5細胞模型，為研究SIRT1基因相關(guān)骨科系統(tǒng)疾病提供實驗基礎(chǔ)。

基因；細胞；細胞模型；慢病毒屬

沉默信息……