一種快速檢測UGT1A1＊28基因多態性的方法

黃迎 蘇健 黃小穗 盧丹霞 謝至 楊素清 郭偉浜 呂志異 吳紅穗 張緒超

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1, UGT1A1 ）是伊立替康（irinotecan）的主要代謝酶，其活性與伊立替康的療效及不良反應密切相關，而UGT1A1*28基因多態性可顯著影響該酶的表達與活性，增加伊立替康化療患者發生腹瀉、嚴重粒細胞減少等不良反應的風險。伊立替康是小細胞肺癌標準二線治療方案，檢測UGT1A1*28基因多態性對于指導肺癌個體化治療具有一定臨床意義[1-4]。

目前檢測基因多態性常用的方法主要包括：Sanger測序法、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis, DGGE）、單鏈構象多態性（single-strand conformation polymorphism, SSCP）、熒光定量PCR、PCR-LDR等多種。Sanger測序法是檢測UGT1A1*28突變的傳統和經典方法，但Sanger測序法耗時，且靈敏度低，僅達10%[5,6]。本研究嘗試用片段分析方法，以期快速、簡便地檢測UGT1A1*28多態性，獲得一種更適用于臨床的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 外周血DNA提取試劑盒（Qiagen公司），緩沖液、超純甲酰胺、POP4膠和GeneScan-500 LIZ Size Standard（美國Applied Biosystems，ABI公司）。3730基因分析儀（美國Applied Biosystems，ABI公司），QIAsymphony SP高通量全自動樣品純化工作站（Qiagen公司），Nano Drop 8000分光光度計（Thermo公司），PCR儀（北京東勝創新生物科技公司），水平電泳儀（德國BIO-RAD公司），UVI凝膠成像系統（德國BioRad公司）。

1.2 樣本及質控品 286例樣本均取自廣東省人民醫院2014年4月-2015年5月住院肺癌患者，抽取靜脈EDTA抗凝全血1 mL。患者臨床特征見表1，所有患者均簽署知情同意書；10份UGT1A1*28質控品來源于國家衛計委。

1.2.1 引物合成 片段分析引物：上游引物：5’FA M-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA3’，下游引物：5’TAGCACCTGACGCCTCGTTGT3'；擴增產物為1 2 8 b p。S a n g e r測序上游引物：5’CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA3’；下游引物：5’ACAACGAGGCGTCAGGTGCTA3’均由Life公司合成。

1.2.2 DNA提取 按試劑說明書提取基因組DNA，測OD值，并配成10 ng/μL。……