重組血管內(nèi)皮抑素對荷人食管鱗癌裸鼠VEGF—C和LYVE—1表達(dá)水平的影響

于俊巖　田向陽　常建蘭　劉平　張蓉　張瑛　黃然欣　喬鮮麗　周文雅

【摘要】 目的 研究重組血管內(nèi)皮抑素（ES）對荷人食管鱗癌裸鼠血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）的調(diào)節(jié)作用。方法 構(gòu)建人食管鱗癌裸鼠模型， 6只瘤周皮下注射ES稀釋液荷瘤裸鼠作為A組， 6只瘤周皮下注射生理鹽水荷瘤裸鼠作為B組， 6只正常裸鼠作為C組， 比較三組血清LYVE-1、VEGF-C的表達(dá)水平， 觀察ES對荷瘤裸鼠LYVE-1和VEGF-C基因表達(dá)的影響。結(jié)果 A、B組血清VEGF-C水平分別為（155.26±10.24）、（180.23±15.64）pg/L， 均高于C組的（103.15±13.20）pg/L， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組血清VEGF-C水平低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A、B組血清LYVE-1水平分別為（65.32±16.29）、（90.58±10.67）pg/L， 均高于C組的（28.31±10.36）pg/L， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組血清LYVE-1水平低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A、B組組織內(nèi)VEGF-C、LYVE-1的PCR擴(kuò)增倍數(shù)均高于C組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組組織內(nèi)VEGF-C、LYVE-1的PCR擴(kuò)增倍數(shù)低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 通過重組ES對TE-1食管鱗癌細(xì)胞荷瘤裸鼠干預(yù)， 重組ES不僅抑制腫瘤新生血管的生成， 而且重組ES可能通過抑制腫瘤組織內(nèi)VEGF-C和LYVE-1的表達(dá)， 對腫瘤新生淋巴管的發(fā)生起到抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 重組血管內(nèi)皮抑素；血管內(nèi)皮生長因子-C；淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1；食管癌；移植瘤模型

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.19.107

Influence by recombinant endostatin on expression levels of VEGF-C and LYVE-1 in nude mice bearing human esophageal squamous carcinoma YU Jun-yan， TIAN Xiang-yang， CHANG Jian-lan， et al. Department of Oncology， Affiliated Heping Hospital of Shanxi Changzhi Medical College， Changzhi 046000， China

【Abstract】 Objective To research regulating effect by recombinant endostatin （ES）on vascular endothelial growth factor-C （VEGF-C）and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1 （LYVE-1）in nude mice bearing human esophageal squamous carcinoma. Methods In establishment of nude mice model bearing human esophageal squamous carcinoma， there were 6 nude mice bearing tumor as group A receiving subcutaneous injection of ES diluents in peripheral tumor skin， 6 nude mice bearing tumor as group B receiving subcutaneous injection of normal saline in peripheral tumor skin， and 6 normal nude mice as group C. Comparison was made on serum expression levels of LYVE-1 and VEGF-C in the three groups. Observation was made on influence by ES on gene expression of LYVE-1 and VEGF-C in nude mice bearing tumor. Results Group A and group B had serum VEGF-C level respectively as （155.26±10.24） and （180.23±15.64） pg/L， which were all higher than （103.15±13.20） pg/L in group C， and their difference had statistical significance （P<0.01）. Group A had lower serum VEGF-C level than group B， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Group A and group B had serum LYVE-1 level respectively as （65.32±16.29） and （90.58±10.67） pg/L， which were all higher than （28.31±10.36） pg/L in group C， and their difference had statistical significance （P<0.01）. Group A had lower serum LYVE-1 level than group B， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Group A and group B both had higher PCR expanding fold of tissue LYVE-1 and VEGF-C than group C， and the difference had statistical significance （P<0.01）. Group A had lower PCR expanding fold of tissue LYVE-1 and VEGF-C than group B， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Intervention by recombinant ES for nude mice bearing TE-1 esophageal squamous carcinoma showed that recombinant ES can not only inhibit neovascularization in tumor， but also show inhibiting effect for lymphangiogenesis in tumor through inhibition of VEGF-C and LYVE-1 in tumor tissue.endprint

【Key words】 Recombinant endostatin； Vascular endothelial growth factor-C； Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1； Esophagus cancer； Transplanted tumor model

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一， 腫瘤血管形成在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用[1]。重組ES是一種新型人ES和抗腫瘤血管生成藥物， 本研究通過重組ES對TE-1食管鱗癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的干預(yù)， 檢測成瘤裸鼠VEGF-C和LYVE-1的表達(dá)水平， 研究重組ES是否對腫瘤新生淋巴管有調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 ①BALB/c雄性裸鼠（SPF清潔級）18只， 5～6周齡， 購于北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所， 飼養(yǎng)于長治醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF清潔級環(huán)境。TE-1食管鱗癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海細(xì)胞庫）。②細(xì)胞培養(yǎng)試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青公司；注射用青霉素鈉100萬單位、注射用硫酸鏈霉素100萬單位購于華北制藥股份有限公司；重組ES購于先聲煙臺麥得津生物工程股份有限公司。小鼠VEGF-C和LYVE-1 Elisa Kit購于上海酶聯(lián)生物。③HyPure TMMolecular Biology Grade Water購于HyClone公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于Thermo公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購于Roche公司；RNA提取液購于武漢谷歌生物科技有限公司；引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

1. 2 方法

1. 2. 1 細(xì)胞及動物培養(yǎng) TE-1食管鱗癌細(xì)胞復(fù)蘇后用RPMI1640培養(yǎng)基和10% FBS在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞， 用生理鹽水重懸制成1×107/ml的瘤細(xì)胞懸液。取12只BALB/c雄性裸鼠在其左側(cè)腹股溝中上部皮下接種瘤細(xì)胞懸液0.1 ml/只。每日觀察裸鼠成瘤情況及生活狀態(tài)， 隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的大小。最后根據(jù)以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積﹦1/2×長徑×短徑。

1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 待裸鼠皮下腫瘤生長到長徑約0.7 cm時， 隨機(jī)把荷瘤裸鼠分為2組， 每組6只。A組：治療組， 隔日瘤周皮下多點(diǎn)注射ES稀釋液， 注射劑量為10 mg/kg， 共28 d。B組：對照組， 隔日瘤周皮下多點(diǎn)注射生理鹽水， 共28 d。另6只正常裸鼠作為C組。處死裸鼠前測量腫瘤的大小、裸鼠的體重；并裸鼠尾靜脈采血約0.5 ml/只。處死裸鼠后取出腫瘤組織、稱重；并解剖裸鼠， 觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)不同的用途處理腫瘤組織。

1. 2. 3 總RNA抽提 ①組織標(biāo)本勻漿：取勻漿器， 加入1 ml的RNA提取液， 置冰上預(yù)冷；取100 mg組織， 加入到勻漿器中， 充分研磨直至無可見組織塊；12000 r/min離心10 min

取上清。②加入250 μl三氯甲烷， 顛倒離心管15 s， 充分混勻， 靜置3 min。③4℃ 下12000 r/min離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中， 加入0.8倍體積的異丙醇， 顛倒混勻；-20℃ 放置15 min。④4℃下12000 r/min離心10 min， 管底的白色沉淀即為RNA；吸除液體， 加入75%乙醇1.5 ml洗滌沉淀；4℃下12000 r/min離心5 min。⑤將液體吸除干凈， 將離心管置于超凈臺上吹3 min；加入15 μl無RNA酶的水溶解RNA；55℃ 孵育5 min。

1. 2. 4 熒光定量PCR（SYBR Green染色法）引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank提供的小鼠VEGF-C（216bp）、LYVE-1 mRNA序列（81bp）， 采用Primer E×press 2.0軟件進(jìn)行引物和探針的設(shè)計并經(jīng)Blast驗(yàn)證。內(nèi)參GAPDH參照文獻(xiàn)[1]合成。見表1。

1. 2. 5 反轉(zhuǎn)錄 取PCR管， 加入含2 μg RNA的溶液；加入1 μl oligo（dT）18；用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μl；于PCR儀上65℃ 保溫5 min， 迅速置冰上冷卻；依次加入4 μl

5×buffer， 2 μl 10 mM dNTPs， 1 μl RNA inhibitor和1 μl 反轉(zhuǎn)錄酶， 用槍抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫60 min， 結(jié)束后80℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

1. 2. 6 定量PCR 取0.2 ml PCR管， 配制如下反應(yīng)體系， 每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管：2×qPCR Mix 12.5 μl；7.5 μM基因引物2.0 μl；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μl；ddH2O 8.0 μl。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s、60℃ 60 s擴(kuò)增40個循環(huán)；溶解曲線75℃→95℃， 每20 s升溫1℃。

1. 2. 7 血清VEGF-C及LYVE-1檢測 小鼠血清VEGF-C和LYVE-1的檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較三組血清LYVE-1、VEGF-C的表達(dá)水平， 觀察ES對荷瘤裸鼠LYVE-1和VEGF-C基因表達(dá)的影響。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果endprint

2. 1 裸鼠血清LYVE-1和VEGF-C的表達(dá)水平 A、B組血清VEGF-C水平分別為（155.26±10.24）、（180.23±15.64）pg/L，

均高于C組的（103.15±13.20）pg/L， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組血清VEGF-C水平低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A、B組血清LYVE-1水平分別為（65.32±16.29）、（90.58±

10.67）pg/L， 均高于C組的（28.31±10.36）pg/L， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組血清LYVE-1水平低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 2 ES對荷瘤裸鼠LYVE-1和VEGF-C基因表達(dá)的影響 A、B組組織內(nèi)VEGF-C的PCR擴(kuò)增倍數(shù)均高于C組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組組織內(nèi)VEGF-C的PCR擴(kuò)增倍數(shù)低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A、B組組織內(nèi)LYVE-1的PCR擴(kuò)增倍數(shù)均高于C組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組組織內(nèi)LYVE-1的PCR擴(kuò)增倍數(shù)低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

食管癌是常見的惡性腫瘤， 除外血道轉(zhuǎn)移， 經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移也是重要的轉(zhuǎn)移途徑。早在1971年Folkman就提出腫瘤生長依賴新生血管生成， 可以通過抑制腫瘤新生血管生成而達(dá)到治療腫瘤的目的[2]。重組ES通過抑制細(xì)胞乏氧誘導(dǎo)因子1-α（Hypoxia Inducible Factor-1α， HIF-1α）和VEGF表達(dá)來抑制腫瘤新生血管的生成[3]。LYVE-1是1999年分離鑒定的第一個淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異的透明質(zhì)酸受體[4]， 僅僅表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞， 在血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)。由于LYVE-1特異性好， 是比較可靠的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物， 被廣泛應(yīng)用于淋巴管生成的研究。VEGF家族成員VEGF-C通過VEGF-C/VEGFR-3信號通路介導(dǎo)腫瘤淋巴管生成和腫瘤經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移[5]。因此本研究通過重組ES對TE-1食管鱗癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的干預(yù)， 檢測成瘤裸鼠VEGF-C和LYVE-1的表達(dá)水平， 研究重組ES是否對腫瘤新生淋巴管有調(diào)節(jié)作用。

腫瘤淋巴管生成是指淋巴內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)或腫瘤組織周圍形成新生的毛細(xì)淋巴管， 而毛細(xì)淋巴管的生成過程非常復(fù)雜， 受多種細(xì)胞因子和信號傳導(dǎo)通路的協(xié)同調(diào)控[6]， 目前對其機(jī)制了解較少。但是在腫瘤淋巴管的生成過程中， VEGF-C和LYVE-1被認(rèn)為發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

淋巴管是腫瘤發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的重要通道， 但迄今為止通過淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明。VEGF-C能促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子， 趨化因子與腫瘤細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合， 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞趨化和粘附， 為腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[7]。

LYVE-1是淋巴管內(nèi)皮上的I型膜蛋白， 主要分布在淋巴管內(nèi)外腔。LYVE-1在區(qū)分腫瘤組織與正常組織中的淋巴管有重要意義， 它能反映腫瘤相關(guān)淋巴管的密度， 可以聯(lián)合其他指標(biāo)判斷腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后[8-10]。

LYVE-1染色陽性管腔視為微淋巴管， 即微淋巴管密度（MLVD）。在TE-1食管鱗癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的既往干預(yù)實(shí)驗(yàn)中， 發(fā)現(xiàn)無論在腫瘤組織還是瘤旁組織， ES治療組明顯低于非治療組。而且ES治療組與非治療組裸鼠腫瘤組織中VEGF-C表達(dá)與MLVD間均存在正相關(guān)。以上結(jié)果從免疫組化及半定量研究說明重組ES可能通過抑制腫瘤組織內(nèi)VEGF-C的表達(dá)， 而對腫瘤新生淋巴管的發(fā)生起到抑制作用。

同樣在重組ES對TE-1食管鱗癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的干預(yù)實(shí)驗(yàn)中， A、B組血清VEGF-C、LYVE-1水平均高于C組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；A組血清VEGF-C、LYVE-1水平低于B組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是既往的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的補(bǔ)充和拓展。

綜上所述， 通過重組ES對TE-1食管鱗癌細(xì)胞荷瘤裸鼠干預(yù)， 重組ES不僅抑制腫瘤新生血管的生成， 而且重組ES可能通過抑制腫瘤組織內(nèi)VEGF-C和LYVE-1的表達(dá)， 而對腫瘤新生淋巴管的發(fā)生起到抑制作用。相信隨著對VEGF家族研究的深入， 重組ES對臨床食管癌的治療機(jī)制必將增添新的基礎(chǔ)研究證據(jù)。

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[收稿日期：2017-04-12]endprint