miR-133b靶向PKM2基因?qū)Ψ伟〢549干細(xì)胞增殖及藥物敏感性的影響

米永華 何苗 劉北忠

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)度大約為18個(gè)-25個(gè)堿基的高度保守的非編碼小分子RNA。可與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]，導(dǎo)致目標(biāo)mRNA的降解或者基因沉默從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、調(diào)亡、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程。已有的研究[2,3]表明miRNA能行使癌基因或抑癌基因的功能，miRNA參與和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的許多重要生物學(xué)過程，包括腫瘤的凋亡、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫反應(yīng)等。研究表明，miR-133b編碼基因位于染色體臂6p[4]，在肺癌組織及患者血清中miR-133b呈低表達(dá)，通過刺激下游信號(hào)通路（Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK、PI3K / AKT、STAT3、FAK等），促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制[5]。劉等[6]研究表明，miR-133b與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）輻射敏感度之間有一定的聯(lián)系，miR-133b可通過靶向PKM2基因治療抗放射性的肺癌。另有研究[7]報(bào)道m(xù)iR-133a和miR-133b可以下調(diào)PKM2表達(dá)從而抑制舌鱗狀細(xì)胞癌的增殖。本實(shí)驗(yàn)通過研究miR-133b與PKM2基因的關(guān)系及其對(duì)肺癌干細(xì)胞的作用，闡明miR-133b抗癌作用的部分機(jī)制，進(jìn)一步證明miR-133b可作為一個(gè)潛在的抗癌新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，DMEM購(gòu)置于Invitrogen，miR-133b模擬物miR-133b mimics、阻遏物miR-133b inhibitor、miR-133b control購(gòu)置于中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，CD133 MicroBead Kit（human）和CD34 MicroBead Kit（human）和購(gòu)置于美國(guó)Miltenyi Biotec公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)置于Invitrogen公司，miRNA提取試劑盒mirVana RNA Isolation Kit，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Taqman miRNA Reverse Transcripation Kit購(gòu)置于美國(guó)ABI公司，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、Annexin V、FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于BD公司，SYBR Green Master購(gòu)置于瑞士羅氏公司，U6內(nèi)參引物于上海生工公司設(shè)計(jì)，GAPDH一抗購(gòu)置于Abcam公司，CCK-8試劑盒購(gòu)置于南京凱基生物有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)置于BD公司。……