丹參酮ⅡA通過增強自噬抑制AGEs誘導內皮細胞凋亡

胡鵬飛　　陸明　　黃抒偉

[摘要] 目的 研究自噬在丹參酮ⅡA抑制晚期糖基化產物（AGEs）誘導內皮細胞凋亡中的作用及相關機制。 方法 丹參酮ⅡA及AGEs處理內皮細胞，MTT法檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot檢測相關蛋白量表達。 結果 與對照組相比，AGEs組和丹參酮ⅡA組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達增加，SQSTM1/p62表達減少，AGEs+丹參酮ⅡA組LC3-Ⅱ表達進一步增加，SQSTM1/p62表達進一步下降。與對照組相比，AGEs組細胞凋亡率增加，細胞活性下降，與AGEs組相比，AGEs+丹參酮ⅡA組細胞凋亡率下降，細胞活性增加，AGEs+自噬抑制劑3-MA組細胞凋亡率增加，細胞活性下降。丹參酮ⅡA組p-AKT、p-mTOR表達下降，呈時間依賴性。 結論 丹參酮ⅡA通過增強自噬抑制AGEs誘導的內皮細胞凋亡，這可能與其抑制AKT/mTOR信號通路相關。

[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；晚期糖基化產物；自噬；內皮細胞；細胞凋亡

[中圖分類號] R363.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）21-0028-05

Tanshinone ⅡA suppresses AGEs-induced endothelial cell apoptosis by enhancing autophagy

HU Pengfei LU Ming HUANG Shuwei

Department of Cardiology， Zhejiang Xinhua Hospital， Zhejiang Traditional Chinese Medicine University Second Affiliated Hospital， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of autophagy in tanshinone ⅡA suppressing AGEs-induced endothelial cell apoptosis. Methods Endothelial cells were managed by tanshinone ⅡA and AGEs， MTT was used to detect cell viability， FCM was used to detect cell apoptosis rate， and Western blot was used to detect protein expression. Results Compared with the control group， the expression of autophagy-associated protein LC3-Ⅱ was enhanced in the AGEs group and the tanshinone ⅡA group， and the expression of SQSTM1/p62 was reduced. The expression of LC3-Ⅱ was further enhanced in the AGEs+tanshinone ⅡA group， and the expression of SQSTM1/p62 was further reduced. Compared with the control group， the rate of cell apoptosis was enhanced， and the cell viability was reduced in the AGEs group. Compared with the AGEs group， the rate of cell apoptosis was reduced and the cell viability was enhanced in the AGEs+tanshinone ⅡA group， and the rate of cell apoptosis was enhanced and the cell viability was reduced in the AGEs+autophagy inhibitor 3-MA group. The expressions of p-AKT and p-mTOR were reduced in the tanshinone ⅡA group， with time dependence. Conclusion Tanshinone ⅡA suppresses AGEs-induced endothelial cell apoptosis by enhancing autophagy， which may be associated with its suppression of AKT/mTOR signal channel.

[Key words] Tanshinone ⅡA； AGEs； Autophagy； Endothelial cell； Apoptosis

晚期糖基化產物（advanced glycation end products，AGEs）是指大分子物質如蛋白質、核酸或脂質在無酶的條件下與其他還原單糖形成的共價化合物，在體內隨年齡增加而逐漸蓄積，在糖尿病尤其糖尿病并發癥、尿毒癥、動脈粥樣硬化、衰老等病理生理過程中起著非常重要的作用[1]。自噬是細胞自身降解大分子或損傷細胞器，維持細胞正常代謝，當細胞自噬水平增強時，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達增加，SQSTM1/p62表達下降，本試驗以此作為判斷自噬水平的標準[2]。我們前期研究發現AGEs能誘導內皮細胞自噬水平升高，自噬做為保護性機制能抑制AGEs誘導的內皮細胞凋亡[3]。為進一步探討是否存在藥物對這一病理過程有干預作用，通過MTT、Western blot、流式細胞術等方法，對丹參酮ⅡA抑制AGEs誘導的內皮細胞凋亡及相關機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

抗LC3-Ⅰ/Ⅱ多克隆抗體、3-MA、MTT、小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、D-葡萄糖均購于Sigma公司；雷帕霉素靶磷酸化蛋白多克隆抗體（phospho-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、激酶B磷酸化蛋白多克隆抗體（phospho-protein kinase B，p-AKT）、雷帕霉素靶蛋白多克隆抗體（mammalian target of rapamycin，mTOR）、蛋白激酶B多克隆抗體（protein kinase B，AKT）購自Cell Signaling Technology公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；細胞內毒素檢測試劑盒購自上海潤成公司；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI凋亡試劑盒購自Invitrogen公司；人臍靜脈內皮細胞株（human umbilical endothelial cells，HUVECs）購自中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的培養 HUVECs接種于含青鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養液中，37℃、5% CO2培養箱常規培養，平均2天更換1次培養液，用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代，等待細胞貼壁24 h后加入AGEs等各項處理因素。

1.2.2 AGEs的制備 參照文獻[4]，將6.0 g D-葡萄糖和1 g BSA溶解于20 mL的0.5 mol/L PBS溶液中，0.22 μm濾器除菌后37℃培養箱內錫紙包裹避光孵化3個月。在同等情況下，用不含葡萄糖PBS緩沖液溶解BSA作為對照組，檢測所有成品內毒素含量<2.5 U/mL。

1.2.3 Western blot檢測蛋白 Western blot檢測LC3-Ⅰ/Ⅱ、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR、mTOR、AKT。按各組處理后收集細胞，用RIPA裂解液裂解后提取上清蛋白，通過BCA法定量，與5×loading buffer混合，煮沸5 min使蛋白變性。將上樣蛋白（40～50 μg）通過SDS-聚丙烯凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉60 min，相應LC3-Ⅰ/Ⅱ、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR、mTOR、AKT抗體孵膜過夜。TBS-T洗滌3次，加入HRP標記二抗共孵育1 h，按1∶1配置化學發光液，使用LAS-4000-mini化學發光系統成像并進行蛋白條帶灰度值分析。

1.2.4 MTT比色法檢測內皮細胞活性 將HUVECs傳代后接種于96孔細胞培養板中，待細胞貼壁24 h后分別加入3-MA（2 mmol/L）、AGEs、丹參酮ⅡA（10 μg/mL）等處理因素，每組5復孔，最終細胞培養液體積200 μL。培養48 h后加入20 μL MTT溶液（濃度5 mg/mL），培養箱中培養4 h后吸棄上清，加入100 μL DMSO溶解沉淀，搖床振蕩5 min，于570 nm波長酶標儀測定吸光度值。

1.2.5 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 雙染標記法檢測細胞凋亡 將對數生長期HUVECs接種于6孔板中（密度：2.0×105/well），貼壁24 h后分別加入AGEs、丹參酮ⅡA（10 μg/mL）、3-MA（2 mmol/L）等處理因素并收集細胞。按Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 凋亡試劑盒說明書操作，重懸細胞后用流式細胞儀FACS Calibur檢測，流式結果通過軟件BD Cell Quest分析。

1.3 統計學處理

所有實驗數據均來自3次以上獨立實驗結果，計量資料以（x±s）表示，采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，兩組間計量資料兩兩比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AGEs及丹參酮ⅡA對內皮細胞自噬水平的影響

為明確AGEs及丹參酮ⅡA對內皮細胞自噬水平的影響，用100 μg/mL AGEs或10 μg/mL 丹參酮ⅡA處理HUVECs 6 h，與對照組比較，AGEs組及丹參酮ⅡA組的自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達量增加，p62表達量下降；AGEs+丹參酮ⅡA組LC3-Ⅱ蛋白表達量繼續增加，p62蛋白表達量繼續下降（P<0.05）（圖1）。以上結果表明AGEs及丹參酮ⅡA均能誘導人臍靜脈內皮細胞自噬水平升高，并有疊加效應。

2.2 丹參酮ⅡA對AGEs誘導內皮細胞凋亡的影響

2.2.1 MTT比色法測定細胞活性 100 μg/mL的AGEs處理內皮細胞48 h，一組與10 μg/mL丹參酮ⅡA共孵育，一組用2 mmol/L 濃度3-MA（自噬抑制劑）提前預處理30 min，與對照組比較，AGEs組內皮細胞活性下降，丹參酮ⅡA組較AGEs組細胞活性升高，3-MA組較AGEs組細胞活性下降，抑制自噬后導致內皮細胞損傷進一步加重。結果表明丹參酮ⅡA能夠抑制AGEs誘導的內皮細胞損傷，自噬在AGEs誘導的內皮細胞損傷中起保護作用。見圖2。

2.2.2 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI雙染標記法檢測細胞凋亡 100 μg/mL的AGEs處理內皮細胞48 h，一組與10 μg/mL丹參酮ⅡA共孵育，一組用自噬抑制劑3-MA（2 mmol/L）提前30 min共培養預處理，AGEs組細胞凋亡率明顯升高，丹參酮ⅡA組較AGEs組細胞凋亡率下降，3-MA組較AGEs組細胞凋亡率升高，抑制自噬加劇AGEs誘導內皮細胞凋亡。以上結果表明丹參酮ⅡA能夠降低AGEs誘導的內皮細胞凋亡，自噬在AGEs誘導的內皮細胞凋亡中起保護作用。

2.3 丹參酮ⅡA對AKT/mTOR信號通路的作用

為明確丹參酮ⅡA對AKT/mTOR信號通路的影響，我們用10 μg/mL丹參酮ⅡA處理HUVECs，在不同時間點收集細胞（0.5 h、1 h），p-AKT和p-mTOR的表達水平隨著作用時間的延長而下降，說明丹參酮ⅡA能夠抑制AKT/mTOR信號通路，并呈時間依賴性（P<0.05）。見圖4。

3討論

血管內皮是血管內壁表層由單層內皮細胞構成的薄膜，是血管壁的屏障。血管內皮細胞損傷與凋亡導致的血管屏障破壞是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的初發病理環節之一[5]。糖尿病患者因代謝異常導致AGEs蓄積，AGEs可通過直接效應或與其受體結合的間接作用導致內皮細胞損傷及凋亡，增加細胞促凝活性，影響內皮細胞舒張功能，并最終導致血管通透性增加，順應性下降，加速動脈粥樣硬化過程[6，7]。

丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TⅡ A）是從植物丹參中提取出來的單體成分，具有活血化瘀通絡的作用，從西醫角度其具有擴血管、抗血小板聚集、抗炎、抑制細胞凋亡與增殖、抗氧化自由基、增加冠脈血流、促進冠脈側支循環形成、降低血壓黏度、改善血液流變學等作用，因此在心血管領域有廣泛的應用[8-10]。我們通過MTT及流式細胞術發現丹參酮ⅡA能抑制AGEs誘導的內皮細胞凋亡，而調節自噬可能是其發揮保護作用的機制之一。張妮等[11]報道丹參酮ⅡA通過調節自噬小體信號通路形成相關蛋白，對ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激損傷具有保護作用。

細胞自噬廣泛存在于真核生物的病理生理過程中，其本身是一個動態的過程：首先，受損的細胞器或大分子被來自內質網的膜延伸包裹形成細胞自噬體，然后與細胞內溶酶體相結合，形成自噬溶酶體，降解所包含內容物供給自身代謝需要并維持細胞穩態[12-14]。適度的自噬是細胞正常生理過程所必需的，但過度的自噬可能對細胞有保護作用，也可能加速細胞損傷，在疾病的不同階段，自噬的作用也不同，在缺血/再灌注損傷中，缺血階段心肌細胞自噬增強，高水平的自噬對心肌細胞具有保護作用，減少心肌細胞損傷，進入再灌注階段后，細胞自噬水平進一步升高，此時過度增強的自噬對心肌細胞造成進一步損傷[15]。多種信號通路能調控細胞自噬水平，其中mTOR（mechanistic target of rapamycin，mTOR）相關信號通路的研究較為透徹，也是最重要的一條通路，mTOR是一個保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，當其磷酸化水平升高后對自噬水平進行負性調節，在mTOR上游，AKT通過TSC1/2（tuberous sclerosis1/2）或PRAS40依賴的途徑激活mTOR，對mTOR進行正向調節并抑制自噬[16-18]。

Verma N等[19]報道晚期糖基化產物通過激活RAF蛋白激酶及NF-κB從而激活細胞自噬水平。Ma M等[20]研究發現晚期糖基化產物通過減少組織蛋白酶D促進大鼠血管平滑肌細胞增殖并抑制其自噬水平。Takahashi A等[21]發現自噬通過抑制腎臟近端小管溶酶體形成和功能從而抑制晚期糖基化產物的蓄積。本課題小組一直從事自噬與AGEs導致的心血管并發癥相關研究。前期研究發現：AGEs誘導的自噬參與AGEs誘導的血管平滑肌細胞增殖，其中AKT和ERK/MAPK信號通路發揮了重要作用[22]；AGEs通過AKT/mTOR和ERK/MAPK信號通路誘導乳鼠心肌細胞自噬水平升高，通過AKT/mTOR和P38/MAPK信號通路誘導乳鼠心肌細胞凋亡增加，自噬在AGEs誘導的心肌細胞凋亡中起保護作用[23]；AGEs誘導內皮細胞自噬水平增強，增強的自噬能抑制AGEs誘導的內皮細胞凋亡[3]。通過實驗，我們發現丹參酮ⅡA能對抗AGEs誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，其機制可能是通過調節AKT/mTOR信號通路從而調節細胞自噬水平。

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（收稿日期：2017-05-11）