高通量測序技術及其在貝類轉錄組研究中的應用

劉敏 葉晟 楊鳳 吳立新

摘要 高通量測序是傳統DNA測序的一次重大技術創新，它為貝類養殖物種的研究帶來了新的機遇。著重對454、Solexa 和 SOLiD高通量測序平臺的技術原理、數據分析及其在貝類轉錄組的研究應用進行綜述，同時對高通量測序未來發展方向做了總結和展望。

關鍵詞 高通量測序；轉錄組；貝類；應用

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0130-04

High-throughput Sequencing Technology and Its Application in the Study of Shellfish Transcriptome

LIU Min，YE Sheng，YANG Feng，WU Li-xin*

（College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract High-throughput sequencing is a major technology innovation of traditional DNA sequencing， which brings new opportunities to the research of shellfish species. This review focused on their technical principles， data analysis of the 454， Solexa and SOLiD high-throughput sequencing platforms and their application in the study of shellfish transcriptome. At the same time， the future development direction of high-throughput sequencing was summarized and forecasted.

Key words High-throughput sequencing；Transcriptome；Shellfish；Application

核酸測序技術是一種重要的分子生物學分析方法，被廣泛地應用在生物學研究中。20世紀70年代，Sanger提出了具有里程碑意義的雙脫氧核苷酸末端終止法[1]，該方法在“人類基因組計劃”實施中發揮了巨大作用。隨著測序技術的不斷發展，第一代測序（Sanger測序）因其成本高、通量低和速度慢等缺點而不能滿足研究者的需求[2]。自2000年以后，高通量測序技術平臺相繼出現，主要包括羅氏的454測序平臺、Illumina的Solexa測序平臺 和 ABI的SOLiD測序平臺，它們以其通量高、速度快、準確度高、成本低等特點而被廣泛應用在非模式生物測序研究中。高通量測序技術在貝類物種的轉錄組研究中發揮了重要作用，主要應用在貝類分子標記篩選、功能基因的挖掘和非編碼miRNA方面的研究中。筆者綜述了高通量測序技術的原理、數據分析及其在貝類轉錄組的研究應用，并展望了高通量測序今后的研究發展方向。

1 高通量測序的原理及測序步驟

高通量測序（High-throughput sequencing）又叫作深度測序或下一代測序，該技術是對Sanger測序的一次重大技術創新，在一次反應中能對數百萬條的核酸序列進行測定。目前，高通量測序技術主要包括Roche/454[3]，Illumina/Solexa[4]和ABI/SOLiD 測序平臺[5]，下面主要針對這3種測序技術的原理進行介紹。

1.1 Roche/454

454測序平臺是采用邊合成邊測序的原理，其測序步驟如下：①DNA文庫構建，將所測核酸序列打斷成幾百bp的小片段后，在兩端分別加上特異性的接頭。②乳液PCR，上述步驟帶接頭的DNA片段會與一個磁珠結合，磁珠被擴增試劑乳化之后，形成油包水的微反應器系統。測序PCR反應就發生在液滴包裹的微反應器里，每一個油滴體系中只包含1個DNA模板。擴增以后，每一個DNA分子都能進行大量富集，最后構成一個克隆集落。454測序儀的測序通道體積狹窄，僅僅能容納一個磁珠。③轉移至PTP 載板（Pico Titer Plate），將每個磁珠移至GS FLX測序儀載樣板的每個小孔內，為測序做準備。④焦磷酸測序，在PTP孔內添加被激活液處理的磁珠，測序系統會把底物的聚合與熒光信號釋放偶聯起來。當發生堿基配對時，釋放的焦磷酸基團在酶的作用下產生級聯反應，獲得測序熒光信號。通過捕捉的熒光信號，就能夠達到核酸測序的目的。與其他高通量測序技術相比，454測序平臺具有測序讀長長和速度快的優點，適合基因組的重測序、從頭測序和宏基因組學等。然而，454測序平臺也存在一些缺點，如成本高、準確率低，對相同堿基聚合區域難以處理。454 測序平臺在性能上很難有升級和突破，所以羅氏公司從2016 年起逐步停止焦磷酸測序儀的生產[6]。

1.2 Illumina /Solexa

Solexa測序平臺的原理是邊合成邊測序，它是基于橋式PCR和可逆終止子的反應，測序步驟如下：①構建文庫，首先把DNA序列隨機打斷成小片段，并在兩端加上特定的接頭。②錨定橋接，將第1步獲得的DNA 片段變性為單鏈，并和接頭引物結合，形成后續擴增的橋狀結構。放大反應在帶有8個通道 的flow cell玻璃管內進行，每一個通道的內表面有許多個固定的單鏈接頭。③預擴增，添加Taq 酶和不帶標記的底物dNTP進行橋式PCR 擴增。在變性時，單鏈橋型片段錨定到附近的固相表面。經過連續的擴增反應，上百萬條成簇的雙鏈DNA待測片段將會在flow cell 的固相表面上。④單堿基延伸測序，在flow cell玻璃管中添加DNA 聚合酶、4種不同的熒光標記dNTP和引物進行擴增，當互補鏈合成時，就會釋放出帶有熒光標記dNTP的熒光，系統根據捕捉的熒光信號就可以推斷出待測的序列信息。

1.3 ABI/SOLiD

SOLiD測序平臺是利用連接酶在連接過程中進行測序的原理，即邊連接邊測序。 SOLiD測序文庫的構建和微乳滴 PCR 擴增與454技術類似，只是SOLiD的微珠更小，只有1 μm。它的特點是采用雙堿基編碼技術（two-base encoding）進行誤差校正，其測序步驟如下：①制備單鏈DNA文庫，將DNA待測序列打斷成很小的片段，并在兩頭添加不同的接頭，連接載體，獲得單鏈DNA文庫。②微乳化PCR（emulsion PCR），將帶有接頭的單鏈DNA固定在磁珠表面，進行 PCR 擴增，并對擴增產物進行 3′端修飾。③轉移至上樣玻片，將磁珠放置在SOLiD上樣玻片（slide），準備測序。④進行雙堿基編碼測序，在體系中加入通用引物、DNA連接酶和帶有 8 個堿基單鏈熒光探針混合物（3′-XXnnnzzz-5′），此探針3′端的第1位和第2位的堿基是確定的，5′端是帶有熒光標記的（根據種類不同在6～8位zzz上加不同的熒光）。SOLiD測序包括5輪測序反應，每一輪反應又由多個連接反應構成。第1輪的第1次測序反應中，當探針3′端的第1和2位在連接酶的作用下進行配對連接時，就會發出熒光信號。記錄熒光顏色信息后，除去6～8 位堿基和淬滅5′末端熒光信號，也就是說，實際上每一次測序的位置都相差5個堿基，第1輪得到第1和第2位的顏色信息。以此類推，第2次測得第6和7位的顏色信息，第3次測得第11和12位的顏色信息，第4次測得第16和17位的顏色信息……第1輪測序之后，將新合成的鏈變性、洗脫，引物重置，進行下一輪測序。由于之后的每一輪引物都要比前一輪引物向前移動1位，所以第2輪將會測得第0～1位、5～6位、10～11位和15～16位等的熒光顏色信息。5輪反應結束后，可以得到全部位置的熒光顏色信息，同時每個位點都會被檢測2次，準確率達99.94%。SOLiD測序儀每次循環可以測75～110 bp，與Solexa技術類似，后續的序列拼接工作需要足夠運算能力的計算機（主要指CPU和內存）和具有一定生物信息學操作經驗的處理人員[7]。

454、SOliD和Solexa技術的測序原理、運行成本和數據輸出量均不相同，但其共同之處是不需要克隆，可以直接進行高通量測序。此外，這3種測序技術也都要進行文庫構建、片段擴增、測序、信號捕獲等環節。研究者可以根據研究目的、試驗經費、測序深度來選擇測序平臺。近年來，利用高通量測序對貝類進行測序研究剛剛興起，加之傳統的Sanger測序成本昂貴，使得貝類的基因組資源缺乏。對于分析貝類這樣的非模式生物，需要找出鄰近物種的基因組數據或較完整的轉錄組信息，若是沒有搜尋到相關信息，在經費允許的情況下454測序可作為首要選擇，從而為研究獲得較長的序列片段。如果試驗經費有限，Solexa測序也可以在被考慮范圍之內，主要體現在2個方面：一方面是可以產生很大的數據量，從而增加測跨區域片段的概率；另一方面是功能強大的軟件不斷地被開發出來，可能使拼接序列的讀長變得稍長些。從這兩方面來看，Solexa測序在某種程度上也削減了短序列帶來的缺陷。

2 高通量測序數據分析步驟

2.1 數據處理

測序獲得的原始讀段（raw reads），結果以fastq格式儲存，并被提交到NCBI SAR數據庫中。數據獲得后要對測序讀段進行統計，通過統計測序質量值分布和堿基分布情況，評估數據量是否滿足后續分析要求。之后對原始數據進行質量評價，過濾掉低質量序列、接頭序列和核糖體，獲得高質量的數據進行接下來的組裝分析。

2.2 數據組裝

轉錄組測序序列組裝包括有參基因組裝和無參考基因組裝（從頭組裝）。

有參基因組裝：利用Scripture或Cufflinks軟件，將測序讀段比對到基因組上，再通過重疊信息得到graph，將graph中的信息進行轉換，最后獲得轉錄本。有參基因組裝具有內存需求小、靈敏度高、污染小和拼接的轉錄本序列較完整等優點，但也存在一些缺點，如依賴參考序列和軟件錯誤比對等。

無參考基因組裝：又稱從頭組裝，常用軟件為Trinity。以Trinity軟件對樣本組裝情況為例，根據序列之間的重疊信息組裝獲得contig，再通過序列的contig和雙末端信息之間的相似性比對，然后進行contig聚類，而后在局部組裝得到transcript[8]。通常把最主要的transcript當成Unigene。獲取的Unigene進行后續的注釋、定量、基因結構分析、基因的表達量差異和差異表達分析。

與有參基因組裝相比，從頭組裝不依賴參考序列、比對軟件，能較好地重建。但是，同樣存在缺點，如要有較大內存和更高的測序深度、敏感性強、高相似度的轉錄本可能被合并等。

2.3 比對及注釋

利用比對軟件將組裝得到的Unigene序列和公共數據庫COG[9]、Swiss-Prot[10] 、 NR[11]、KEGG[12]進行相似性搜查，若是Unigene序列被比對到高優先級的數據庫，就不用進行下一輪比對，否則仍會與之后的database比對完。在BLAST結果中，取比對到相似性最高的蛋白，最后得到這個Unigene的功能注釋信息。將NR比對的結果輸入到Blast2GO軟件[13]中，就可以獲得Unigene序列的GO注釋信息。獲得GO注釋后，通過WEGO軟件[14]可以統計GO功能分類，從而了解物種的基因功能。目前，采用的蛋白質數據庫包括PDB、TrEMBL 和Swiss-Prot等。

3 高通量測序在貝類轉錄組研究中的應用

轉錄組是指細胞或特定組織在某一狀態下轉錄出來的所有RNA集合。以真核生物基因組研究為例，轉錄組測序比全基因組測序針對性更強，僅僅研究被轉錄的部分，既減小了研究范圍又降低了成本。此外，通過基因表達譜量的變化確定是否有某個特定基因，轉錄組是作為衡量功能基因組研究的一個重要指標。近些年，高通量測序技術被廣泛應用在貝類轉錄組研究中，同時大量的貝類轉錄組研究文章被發表，取得了很大成果。

3.1 高通量測序在貝類分子標記開發中的應用

高通量測序技術作為一種快速開發分子標記的有效方法，越來越受到研究人員的青睞。通過高通量測序開發的分子標記主要包括簡單重復序列（SSR）和單核苷酸多態性（SNP）。簡單重復序列是指由2～6個核苷酸為重復基序的串聯的DNA序列組成，具有高多態性、穩定性強和共顯性遺傳等特點，主要用于遺傳分析、遺傳圖譜構建、親緣關系鑒定和分子標記輔助育種。單核苷酸多態性是指由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性，通常用于鑒別生物體的遺傳變異。對SSR標記而言，一般采用MISA軟件進行SSR標記篩查。MISA軟件是一個可以大量識別和定位SSR序列的篩查工具，同時，它還提供了一個和引物設計Primer3的接口工具，利用這個工具可以將識別的SSR轉成Primer3的格式，為設計引物提供了便利條件。Hou等[15]利用454 GS FLX測序系統對蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）進行轉錄組測序分析，檢測到了超過49 000 SNPs和2 700 SSRs。Wang等[16]對櫛孔扇貝（Chlamys farreri）進行高通量測序，并與之前研究的蝦夷扇貝測序進行比較分析，38個假定的快速演變基因和大量的SNP被辨別。Niu等[17]在對縊蟶（Sinonovacula constricta）的轉錄組研究中也檢測到大量的SSR和SNP。Franchini等[18]對中間鮑（Haliotis midae）進行了轉錄組測序，研究獲得了數以千計的分子標記SSR（4 707個contigs鑒定出7 381）和SNP（4 380個contigs鑒定出11 934），同時為大量的SSR設計出高質量的PCR引物。Chen等[19]利用Illumina測序平臺對河蜆（Corbicula fluminea）進行了轉錄組測序，鑒定出2 151條SSR序列。此外，還有其他貝類物種利用高通量測序技術去開發分子標記，如蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）[20]、大珠母貝（Pinctada maxima）[21]和褶紋冠蚌（Cristaria plicata）[22]等。從這些例子看出，利用454和Solexa測序技術可以大量挖掘分子標記SSR和SNP，它成為快速開發分子標記的一條有效途徑。同時，這些分子標記非常有助于進一步分析群體遺傳結構和構建遺傳圖譜。

3.2 高通量測序在挖掘貝類功能基因或新基因中的應用

根據試驗方案：①取不同發育時期或經過脅迫（重金屬、菌、溫度或鹽度脅迫等）處理的生物個體組織，然后提取RNA。②轉錄組測序后，利用組裝的序列和數據庫的序列進行相似性比對，研究者可以尋找到功能基因、新基因或差異表達基因等。

Moreira等[23]利用454測序技術對實施體外刺激的菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）進行轉錄組測序，產生了平均讀長為250 bp的974 976個高質量讀段，利用這些讀段組裝得到51 265個contigs，其中有22 915個contigs被注釋。在注釋的結果中，發現35個contigs包括大量的免疫相關基因，并且詳盡地分析展示出幾個免疫通路和進程的假定成員。同時，在補體途徑中發現了雙殼類從未被描述的分子序列。和454測序技術相比，盡管Solexa序列要比454所測讀長短，但是它的應用性和測序深度要遠大于454技術。Meng等[24]利用Illumina測序平臺對鎘暴露的蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）進行測序，14 240條序列被注釋。通過GO注釋和KEGG通路分析，辨別出720個基因涉及刺激反應和302個基因涉及免疫反應通路。此外，利用數字基因表達圖譜DGE系統對鰓和消化腺檢測轉錄組變化，在這2個組織分別檢測到了7 556和3 002個差異表達基因。此外，Meng等[25]為了闡明銅暴露在免疫系統上的毒理學機制，以之前研究的蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）為材料，利用Illumina HiSeq 2000研究其鰓組織中的差異表達基因和轉錄本豐度。總共鑒定了1 312個上調基因和2 237個下調基因。同時，顯著富集分析確定了9個GO術語和38個涉及銅暴露反應的途徑。Zhang等[26]利用Illumina測序技術對美洲牡蠣（Crassostrea virginica）進行轉錄組分析揭示其先天免疫相關基因的豐富性。測序組裝得到66 229個contigs，它涵蓋了89.4%的已發表的EST和97.9%的線粒體基因，并且39 978個contigs和unigenes被辨別和注釋。仍有26 251個contigs沒有出現在比對的數據庫中，說明Illumina測序可以勝任轉錄組深度測序的工作。

Qin等[27]利用454測序技術在8個不同的早期發育階段對葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）進行de novo轉錄組測序，提供了深度覆蓋的EST數據庫，并注釋了大量的序列數據，同時鑒定和量化了6個獨特序列涉及生長和早期發育的一些功能基因，例如腎上腺素能受體、多巴胺受體、表皮生長因子受體（EGFR）、胰島素樣生長因子1受體（IGFR），胰島素誘導的蛋白質，卵泡抑素前體。Huan等[28]對文蛤（Meretrix meretrix）的4個不同幼蟲期進行轉錄組測序，總共獲得704 671個讀數，并組裝成124 737個獨特序列（35 205個重疊群和89 532個單獨序列）。進一步分析顯示，這些序列中的94.66%（118 075個）是低表達水平的轉錄本。通過對UniProt蛋白質數據庫進行搜索，15 000 215個（12.20%）序列被注釋。通過分析每個獨特序列的深度，進行初步定量分析，大量序列顯示了4個幼蟲階段之間的轉錄差異，其與發育、生長、殼形成和免疫應答等相關。Song等[29]利用Hiseq 2500測序平臺對脈紅螺（Rapana venosa）的6個不同發育時期進行轉錄組測序和分析，對6個涉及神經分泌功能序列進行了量化和鑒定。對unigenes涉及的各種生物過程中的功能注釋可以刺激對該物種早期發育機制的研究，同時了解早期發育和變態的機制將有利于該物種的水產養殖。

研究者利用高通量測序技術在對其他雙殼貝類轉錄組研究中也發現了功能基因，如櫛孔扇貝[16]、合浦珠母貝（Pinctada martensii）[30-31]、河蜆[19]、南極帽貝（Laternula elliptica）[32]、中國蛤蜊（Mactra chinensis）[33]和紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）[34]等。

3.3 高通量測序在貝類MicroRNA發現和功能研究中的應用

微小RNA（miRNA）是一類長度為20～25個核苷酸（nt）的小非編碼RNA，其在動物和植物中進行轉錄后的基因表達調節[35]。隨著更多miRNA的調節靶基因和其功能被發現，miRNA指導的基因調節的廣度和重要性開始備受關注。近年來，利用高通量測序有很多關于貝類的miRNA研究，其研究表明miRNA控制很多細胞功能，包括代謝、增殖、凋亡和免疫等，控制了不同生物代謝通路多個基因的表達，在貝類生長和發育中扮演重要角色。

對于小RNA（miRNA）測序而言，Illumina和SOLiD測序平臺要優于454測序平臺，因前兩者有更大的單次數據產出量，可以提供一定的測序深度，從而提高其測序覆蓋度。Bao等[36]對泥酣（Tegillarca granosa）血細胞miRNA進行測序，2個小RNA文庫被構建（對照組和Cd處理組），經過與miRBase 數據庫進行比對，總共鑒定出215個保守的miRNA，同時在沒有泥酣參考基因組序列的情況下，利用生物分析發現39個泥酣特有的miRNA。在Cd刺激的文庫中有5個miRNA表達顯著上調，11個miRNA表達顯著下調，上調miRNA主要涉及發育和細胞進程，下調miRNA在胚胎發育、炎癥反應和免疫應答中發揮重要作用。Zhao 等[37]利用2種牡蠣物種香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）和長牡蠣（C.gigas）進行低鹽度脅迫，并對鰓組織構建的4個小RNA文庫進行高通量測序。在長牡蠣中鑒定出137個保守的和65個新的miRNA，同時在香港牡蠣中也鑒定85個保守的和2個新的miRNA。此外，在香港牡蠣物種中，顯示相反表達類型的5個miRNA-mRNA互作對被辨別。對這些辨別的miRNA進一步研究，可能會揭示其在應答脅迫中的重要作用，從而為闡明牡蠣耐鹽的分子機理提供線索。Jiao等[38]利用Illumina/Solexa深度測序對合浦珠母貝MicroRNA進行描述和辨別，研究鑒定出258個MicroRNA，其中，205個是跨物種保守的，53個是其特有的。一些pm-miRNA被預測參與生物礦化，例如miR-2305和miR-0046。Zhou等[39]利用Illumina平臺對來自牡蠣血細胞的3個小RNA文庫進行測序，以研究細菌攻擊和熱脅迫后miRNA的潛在免疫調節作用。對數據進行分析，鑒定出199個牡蠣miRNA（71種已知的和128種新型的）。研究顯示免疫攻擊可以誘導表達miRNA，其可以調節免疫應答，例如吞噬作用和凋亡。此外，一些免疫相關的表達miRNA也可以通過熱應激來調節改善牡蠣對環境的適應。Chen等[40]也對刺激后的牡蠣血細胞miRNA進行了免疫調節研究。關于miRNA的研究還有中間鮑[41] 和長牡蠣[42]。這些在某階段特異表達的miRNA可能會在一些生物進程中發揮重要作用，因此，miRNA的測序分析將會促進靶基因功能研究。

4 展望

近些年，高通量測序技術被廣泛應用在貝類轉錄組的功能基因研究中。對于貝類這樣的非模式生物，大多是無參考基因組序列的物種，通過高通量測序可以在短時間內產生海量數據，這些數據信息將會豐富貝類物種的遺傳數據庫，并且有利于這些物種進行深入的分子生物學研究。

高通量測序雖然在轉錄組學和分子生物學的研究中發揮了重要作用，但是在大量序列的拼接上仍然有不足之處。后續的拼接（序列的準確性和完整性）工作對于分子標記的開發和獲取有意義的信息非常重要。在分子標記開發方面，錯誤拼接會導致標記擴增失敗，同時太短序列的拼接也會增添設計引物的困難。研究者可以著手對拼接方法和測序工藝進行改進，從而增加序列的拼接長度。面對這些龐大的數據分析，如何得到有用的生物信息學信息將成為之后研究的熱點。今后高通量測序技術會在各領域有更廣泛的應用，為分子標記和功能基因的挖掘提供一條便利的途徑，從而極大地促進遺傳分析和分子育種方面的研究。

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