HOTAIR通過E-cadherin對膠質瘤侵襲和轉移的影響研究

李錫清 趙尊蘭 劉冬玲 劉明月 馬 寧 李 明 周 云△

1)河南省人民醫院腫瘤科，河南 鄭州 450003 2)河南省人民醫院全科醫學科，河南 鄭州 450003 3)美國加州大學圣地亞哥分校藥學院 4)河南省人民醫院神經外科，河南 鄭州 450003

·論著 科研之窗·

HOTAIR通過E-cadherin對膠質瘤侵襲和轉移的影響研究

李錫清1)趙尊蘭2)劉冬玲3)劉明月1)馬 寧1)李 明4)周 云1)△

1)河南省人民醫院腫瘤科，河南 鄭州 450003 2)河南省人民醫院全科醫學科，河南 鄭州 450003 3)美國加州大學圣地亞哥分校藥學院 4)河南省人民醫院神經外科，河南 鄭州 450003

目的 觀察HOTAIR對膠質瘤細胞侵襲和轉移能力的影響。方法 使用q-PCR從臨床標本中檢測HOTAIR與E-cadherin的關系，體外常規培養SWO-38和U251細胞，過表達HOTAIR后使用劃痕實驗檢測細胞侵襲、遷移能力；Western blotting檢測細胞中E-cadherin蛋白的表達。結果 q-PCR膠質瘤組織中HOTAIR高表達組中E-cadherin表達的均值較低，較HOTAIR低表達組低，差異有統計學意義(P<0.05)；在SWO-38和U251細胞中過表達HOTAIR后Western blotting檢測發現E-cadherin表達減少，劃痕實驗顯示過表達HOTAIR后細胞遷移能力增強。結論 HOTAIR可增加膠質瘤的侵襲和轉移，可能與其降低E-cadherin蛋白的表達有關。

膠質瘤；HOTAIR；E-cadherin侵襲

膠質瘤在神經系統中是惡性程度最高的腫瘤，盡管膠質瘤能從手術和化放療中獲益，但中位生存期約12個月，大部分病人治療后再次復發[1]。為獲得更好的治療效果，需從膠質瘤的分子生物學機制進行研究[2]。長鏈非編碼RNA通過對mRNA的影響，對膠質瘤的生長和轉移產生影響，我們的前期研究表明，HOTAIR對腸癌和肺癌的治療效果及預后產生影響[3-4]。也有報道顯示，HOTAIR在膠質瘤中發生發展中發揮作用。E-cadherin通過對EMT的影響，作為腫瘤侵襲和轉移的關鍵基因在很多腫瘤中發揮作用[5]，我們的前期工作在鼻咽癌中也證實E-cadherin和侵襲和轉移相關；也有研究表明，E-cadherin在膠質瘤中發揮抑癌作用[6]。但目前HOTAIR和E-cadherin在膠質瘤中的表達關系尚無研究報道。本研究擬從HOTAIR和E-cadherin在膠質瘤中的表達關系進行研究，分析其在膠質瘤中可能的作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 臨床資料和試劑：選取2011-09—2013-09在我院經病理學切片檢查確診為膠質瘤并實施手術治療的患者60例，年齡(55±17)歲。取患者的腫瘤組織及癌旁邊緣正常組織，標本離體后30 min內轉移到液氮保存備用。SWO-38和U251細胞購自上海拜力生物科技有限公司。E-cadherin抗體購自美國Santa Cruze公司。RNA提取及實時熒光定量PCR所用試劑購自美國Invitrogen公司，RNAs引物由上海生工合成，PCR試劑盒購自日本Takara公司。Western blotting試劑購自廣州康為生物科技有限公司。HOTAIR模擬物和抑制劑由上海吉瑪公司合成。將HOTAIR擴增后克隆進入過表達載體pCDH-MSCV-mcs-EF1-GFP-T2A-Pu(SBI)，并包裝成為慢病毒感染細胞，表達和對照質粒均來自ADDGENE(美國)，包裝質粒psPAX2和pMD2.G由 Didier Trono教授贈送(University of Geneva，Geneva，瑞士)。1．2 q-PCR檢測HOTAIR和E-cadherin在膠質瘤中的表達 實時熒光定量PCR檢測膠質瘤組織中HOTAIR和E-cadherin的表達，引物見表1，依據Trizol說明書提取貼壁細胞的總RNA。實時熒光定量PCR：采用莖環法進行miRNAs逆轉錄，20 μL體系：8 μL ddH2O、1 μL RNA模板、RNAs莖環逆轉錄特異性引物和內參U6逆轉引物各1 μL混勻，65 ℃ 5 min，按PCR說明書加樣后上機檢測。miRNAs的表達量以U6為內參，用2-△△Ct計算，△△CtmiRNAs=(CtRNAs-CtU6)處理組-(CtRNAs-CtU6)對照組。

表1 qPCR所用的引物

1．3 劃痕實驗檢測HOTAIR對膠質瘤細胞侵襲能力的影響 在膠質瘤SWO-38和U251細胞中過表達HOTAIR，取1×106個細胞接種于12孔板中過夜貼壁，劃痕，換培養基，繼續培養24 h，顯微鏡下觀察細胞的體外遷移、侵襲能力。

1．4 Western blotting檢測HOTAIR對膠質瘤細胞中E-cadherin蛋白表達的影響 在膠質瘤SWO-38和U251細胞中過表達HOTAIR后，收集蛋白，上樣，恒壓90 V電泳30 min后110 V電泳60 min。轉膜后用5% BSA室溫封閉1 h。一抗按1：500比例稀釋，4 ℃下孵育18 h以上，TBST洗膜3次，10 min/次。二抗按1：2 000稀釋室溫孵育2 h，檢測相應蛋白的表達量。

2 結果

2．1 HOTAIR在膠質瘤組織中表達高于相應癌旁手術邊緣正常組織 RT-qPCR定量結果顯示，HOTAIR在膠質瘤患者癌組織標本的Ct值明顯低于相應癌旁正常組織，表明HOTAIR在膠質瘤組織中表達上調。60例患者癌組織中HOTAIR的相對表達量高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)，對應的檢測E-cadherin在膠質瘤及癌旁正常組織中的表達發現，正常組織中的E-cadherin表達明顯高于癌組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

2．2 膠質瘤組織中HOTAIR表達水平與E-cadherin表達之間的關系 HOTAIR的中位值作為分界點，把膠質瘤組織中HOTAIR的表達分為高表達組和低表達組，對比2組的E-cadherin表達發現，HOTAIR高表達組中E-cadherin的表達量相對較低，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖1 HOTAIR在膠質瘤中的表達量高于癌旁正常組織

圖2 E-cadherin在膠質瘤中的表達量低于癌旁正常組織

圖3 膠質瘤組織中HOTAIR高表達組E-cadherin表達相對量低于低表達組

2．3 過表達HOTAIR可引起膠質瘤細胞的侵襲能力增強 將過表達HOTAIR的SWO-38和U251細胞及其對照細胞傳代到TRANSWELL，培養基進行培養24、48和72 h，將TRANSWELL膜取下，進行染色，顯微鏡下觀察細胞侵襲并穿透TRANSWELL膜的數量，可明顯看出HOTAIR引起膠質瘤細胞侵襲的細胞數量增加(表2)。

表2 膠質瘤細胞侵襲TRANSWELL膜的數量

2．4 HOTAIR過表達后可引起E-cadherin表達降低 過表達HOTAIR的SWO-38和U251細胞及其對照細胞進行培養，Western blot檢測發現膠質瘤細胞中過表達HOTAIR后Ecadherin表達水平明顯下降(圖4)。

SWO-38 U251

注：Cont為對照組，GAPDH為內參圖4 過表達HOTAIR后Ecadherin表達水平發生改變

3 討論

HOTAIR是關注度最高的LncRNAs。一般認為，LncRNAs為類似mRNA的長鏈非編碼RNA，一般長度大于200 bp。運用目前的測序方法表明人體內有20 000個LncRNAs[7]，LncRNAs可預測治療效果和病人預后。HOTAIR的研究表明主要發揮癌基因的作用，并對腫瘤的侵襲和轉移發生作用，目前的熱點在于發現和闡明其靶基因的作用[8]。

我們的研究表明，膠質瘤組織中的HOTAIR表達根據中位值分為高表達組和低表達組，高表達組中E-cadherin低表達，體外實驗同樣表明，過表達HOTAIR后膠質瘤細胞中的E-cadherin低表達，說明HOTAIR和E-cadherin之間存在關系，這可能是HOTAIR影響膠質瘤轉移的作用靶點。

既往研究表明，HOTAIR通過對PDCD4的影響來對膠質瘤的侵襲和轉移產生作用；同時，也有研究表明，PDCD4和E-cadherin之間存在相互調節的關系[9]，且E-cadherin和侵襲、轉移的關系更密切。因此，我們的研究證實了HOTAIR可通過對E-cadherin的作用發揮抗膠質瘤轉移的作用。

目前，在HOTAIR的靶基因研究中，靶基因的確定和miRNA相似，主要通過確定結合位點，但長鏈非編碼RNA的靶點確定較miRNA的互補結合更復雜[10]。雖本研究中明確HOTAIR和E-cadherin之間存在關系，但還不能證實兩者存在直接的調節關系，需后續研究進一步證實。

[1] Chen Y，Bian Y，Zhao S，et al．Suppression of PDCD4 mediated by the long non-coding RNA HOTAIR inhibits the proliferation and invasion of glioma cells[J]．Oncol Lett，2016，12(6)：5 170-5 176．

[2] Kiang KM，Zhang XQ，Leung GK．Long Non-Coding RNAs：The Key Players in Glioma Pathogenesis[J]．Cancers (Basel)，2015，7(3)：1 406-1 424．

[3] Liu MY，Li XQ，Gao TH，et al．Elevated HOTAIR expression associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer patients[J]．J Thorac Dis，2016，8(11)：3 314-3 322．

[4] Luo ZF，Zhao D，Li XQ，et al．Clinical significance of HOTAIR expression in colon cancer[J]．World J Gastroenterol，2016，22(22)：5 254-5 259．

[5] Pantazi E，Gemenetzidis E，Teh MT，et al．GLI2 Is a Regulator of beta-Catenin and Is Associated with Loss of E-Cadherin，Cell Invasiveness，and Long-Term Epidermal Regeneration[J]．J Invest Dermatol，2017 Mar 11．[Epub ahead of print]

[6] Iwadate Y．Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression[J]．Oncol Lett，2016，11(3)：1 615-1 620．

[7] Zhang R，Xia LQ，Lu WW，et al．LncRNAs and cancer[J]．Oncol Lett，2016，12(2)：1 233-1 239．

[8] Weidle UH，Birzele F，Kollmorgen G，et al．Long Non-coding RNAs and their Role in Metastasis[J]．Cancer Genomics Proteomics，2017，14(3)：143-160．

[9] Wang Q，Sun ZX，Allgayer H，et al．Downregulation of E-cadherin is an essential event in activating beta-catenin/Tcf-dependent transcription and expression of its target genes in Pdcd4 knockdown cells[J]．Oncogene，2010，29(1)：128-138．

[10] Botti G，Marra L，Malzone MG，et al．LncRNA HOTAIR as Prognostic Circulating Marker and Potential Therapeutic Target in Patients with Tumor Diseases[J]．Curr Drug Targets，2017，18(1)：27-34．

(收稿 2017-03-03)

責任編輯：夏保軍

Study of HOTAIR effect invasion and metastasis of glioma by E-cadherin

LiXiqing﹡，ZhaoZunlan，LiuDongling，LiuMingyue，MaNing，LiMing，ZhouYun

﹡DepartmentofOncology，thePeople’sHospitalofHenanProvince，Zhengzhou450003，ChinaCorrespondingauthor：ZhouYun，Email：zlk092@126.com

Objective To observe the effect of HOTAIR on invasion and metastasis of glioma．Methods Using q-PCR to test the relationship between HOTAIR and E-cadherin from clinical specimens．The invasion and metastasis of cells were tested through Wound Healing after HOTAIR overexperssion in the conventional culture SWO-38 and U251 cells in vitro．Western blotting was used to test the expression of C-cadherin protein in cells．Results In q-PCR glioma tissue，the expression average of E-cadherin was lower in HOTAIR high expression than that in HOTAIR low expression．The difference was statistically significant．After overexpression HOTAIR in SWO-38 and U251 cells，the expression E-cadherin was decreased through Western blotting detection．Wound Healing showed that the ability of metastasis was enhanced after HOTAIR overexpression．Conclusion HOTAIR can increase the invasion and metastasis of glioma，which may be related to the decreased E-cadherin expression．

Glioma；HOTAIR；E-cadherin invasion

國家自然科學基金(U1504820)

R730.264

A

1673-5110(2017)13-0001-04

△通信作者：周云，主任醫師，教授，河南省人民醫院腫瘤科主任，研究方向：惡性腫瘤的化療及綜合治療。Email：zlk092@126.com