增生型糖尿病視網膜病變患眼玻璃體、增生膜組織miR-195表達及意義

張小露，高永峰

(1平頂山市第二人民醫院，河南平頂山467002；2河南省眼科研究所 河南省立眼科醫院)

增生型糖尿病視網膜病變患眼玻璃體、增生膜組織miR-195表達及意義

張小露1，高永峰2

(1平頂山市第二人民醫院，河南平頂山467002；2河南省眼科研究所 河南省立眼科醫院)

目的 探討miR-195在增生型糖尿病視網膜病變(PDR)發生、發展中的作用及機制。方法 選取PDR患者56例(觀察組)、特發性黃斑裂孔患者30例(對照組)，均為單側發病。兩組均接受常規玻璃體切割術，觀察組術中采集玻璃體及視網膜前增生膜組織，對照組采集玻璃體及內界膜組織。采用實時熒光定量PCR法檢測兩組玻璃體和膜組織miR-195和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA相對表達量，Western blotting法檢測兩組膜組織HMGB1蛋白相對表達量，并分析觀察組玻璃體、膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對表達量的關系。結果 觀察組玻璃體及膜組織miR-195相對表達量均低于對照組，HMGB1 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.01)。觀察組膜組織HMGB1蛋白相對表達量為0.94±0.11，對照組為0.58±0.09，兩組比較P<0.05。觀察組玻璃體及膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對表達量均呈負相關(r分別為-0.369、-0.508，P均<0.05)。結論 PDR患眼玻璃體及增生膜組織中miR-195表達均降低，其可能通過負性調控HMGB1表達而參與PDR的發生、發展。

增生型糖尿病視網膜病變；玻璃體；增生膜組織；微小RNA-195；高遷移率族蛋白B1

增生型糖尿病視網膜病變(PDR)是2型糖尿病患者常見的一種微血管并發癥，是導致患者視力喪失甚至失明的重要原因[1]，目前其發病機制尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，以下稱miRNA)為廣泛存在于生物體內的高度保守短小RNA，在細胞增殖、 分化、 凋亡、 免疫反應、腫瘤發生等多種生理、病理過程中發揮重要作用[2]。研究發現，某些miRNAs參與了糖尿病視網膜病變的發生與發展[3]，其中miR-195可通過抑制血管內皮生長因子(VEGF)表達而減少腫瘤組織中微血管的生成[4,5]。本研究觀察了PDR患眼玻璃體及視網膜前增生膜組織中miR-195的表達變化，并探討其在PDR發生、發展中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年5月～2016年5月于平頂山市第二人民醫院眼科擇期行玻璃體切割術的PDR患者56例(均為單側發病，觀察組)，男35例、女21例，年齡42～71(54.6±9.5)歲，糖尿病病程5～20(11.8±4.1)年；合并其他疾病情況：糖尿病腎病15例，大血管病變7例；根據中華醫學會眼科學分會制定的分期標準[6]：Ⅴ期34眼、Ⅵ期22眼。納入標準：①2型糖尿病所致PDR；②反復出現玻璃體積血，未經藥物治療或經藥物治療效果不佳，B超檢查示視網膜前機化膜形成和(或)出現牽拉性視網膜脫離；③未出現明顯玻璃體積血，但B超、檢眼鏡或光相干斷層掃描檢查示眼底出現增生膜和(或)出現牽拉性視網膜脫離。排除標準：①空腹血糖>8 mmol/L或合并嚴重高血壓者；②有玻璃體視網膜或其他眼部手術史者；③接受抗新生血管藥物治療者；④其他因素所致視網膜增生、視網膜血管性疾病者；⑤合并惡性腫瘤、免疫系統疾病及急慢性感染者。同期選擇擇期行玻璃體切割術的特發性黃斑裂孔患者30例(均為單側發病，對照組)，男16例、女14例，年齡40～72(55.6±9.8)歲，排除合并其他眼部疾病、惡性腫瘤、免疫系統疾病及急慢性感染者。兩組性別、年齡具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 玻璃體和膜組織miR-195、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。患者均接受常規玻璃體切割術，于灌注前使用玻璃體切割頭，抽取玻璃體0.6 mL，置于微量離心管中；同時術中留取觀察組視網膜前增生膜和對照組內界膜組織，-80 ℃保存備用。取兩組玻璃體或膜組織，加入細胞裂解液進行裂解，TRIzol總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測純度，以A260/A280≥1.80視為合格樣品。采用逆轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用PCR試劑盒(美國Invitmgen公司)進行PCR反應。miR-195、HMGB1及內參引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。miR-195引物：上游引物：5′-GCACGGTAGCAGCACAGAAA-3′，下游引物：5′-CACTTCCTCAGCACTTGTTGGTAT-3′，引物長度126 bp。 內參U6引物：上游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′， 引物長度318 bp。HMGB1引物：上游引物：5′-GAGCATAAGAAGAAGCACCCAGAT-3′，下游引物：5′-GGGCGATACTCAGAGCAGAAG-3′，引物長度399 bp。內參β-actin引物：上游引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，引物長度317 bp。PCR反應條件：94 ℃、1 min；92 ℃、30 s，58 ℃、30 s，75 ℃、30 s，共40個循環。每個樣本設置3個平行反應復孔，采用2-ΔΔCt法計算兩組玻璃體和膜組織miR-195、HMGB1 mRNA相對表達量。

1.3 膜組織HMGB1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取兩組患眼膜組織，研磨后加入細胞裂解液進行裂解，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用BCA法對蛋白純度進行檢測。取20 μg蛋白樣品，沸水中煮5 min使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜。封閉液封閉過夜，加入一抗兔抗鼠HMGB1多克隆抗體(1∶2 000)，室溫孵育120 min，TBST清洗3次；加入二抗室溫孵育60 min，TBST清洗3次。采用ECL發光試劑盒發光顯影，凝膠圖像處理系統LabWork 4.0軟件對條帶灰度值進行分析。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白β-actin條帶灰度值的比值計算HMGB1蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組玻璃體miR-195、HMGB1 mRNA表達比較 觀察組玻璃體miR-195相對表達量低于對照組，HMGB1 mRNA相對表達量高于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組玻璃體miR-195、HMGB1 mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2 兩組膜組織miR-195、HMGB1 mRNA表達比較 觀察組膜組織miR-195相對表達量低于對照組，HMGB1 mRNA相對表達量高于對照組(P均<0.01)。見表2。

表2 兩組膜組織miR-195、HMGB1 mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.3 兩組膜組織HMGB1蛋白表達比較 觀察組膜組織HMGB1蛋白相對表達量為0.94±0.11，對照組為0.58±0.09，兩組比較P<0.05。

2.4 miR-195與HMGB1 mRNA表達的關系 觀察組玻璃體和膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對表達量均呈負相關(r分別為-0.369、-0.508，P均<0.05)。 3 討論

PDR發生機制較為復雜，可能與體內炎癥反應、自由基生成、糖基化終末產物堆積、二酰甘油-蛋白激酶C系統活化等多種病理過程有關[7,8]。糖尿病視網膜病變患者血清VEGF水平顯著升高，且與病變嚴重程度有關[9]。而miR-195與腫瘤組織中微血管生成有關[10]，且可抑制VEGF表達[11]。因此，推測miR-195表達變化可能與糖尿病視網膜病變有關。本研究顯示，觀察組玻璃體及視網膜前膜組織miR-195相對表達量均明顯低于對照組，說明PDR患眼玻璃體和視網膜前增生膜組織中miR-195表達降低，可能與PDR的發生有關。

HMGB1作為維持核小體結構及調節基因轉錄的非染色體核蛋白，是一種新型的促炎細胞因子，在多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病的發生中發揮重要作用[12]。研究發現，炎癥反應在糖尿病視網膜病變微血管損傷中發揮重要作用，且參與糖尿病視網膜病變的發生及發展過程[13]；釋放到細胞外的HMGB1可觸發炎癥反應，并誘導血管新生[14]；HMGB1可通過升高VEGF表達而促進缺血組織中的血管新生[15]。因此推測，HMGB1可能參與了PDR的炎癥反應及血管生成。本研究觀察組玻璃體及膜組織HMGB1 mRNA相對表達量均高于對照組，膜組織HMGB1蛋白相對表達量亦高于對照組，說明HMGB1表達降低與PDR的發生有關。有研究指出，HMGB1是miR-195潛在的靶基因[16]。本研究觀察組玻璃體和膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對表達量均呈負相關。由此推測，miR-195可能通過負性調控HMGB1的表達而促進炎癥反應及血管生成，從而參與PDR的發生與發展。

綜上所述，PDR患眼玻璃體和增生膜組織中miR-195表達降低，其可能通過負性調控HMGB1表達而參與PDR的發生、發展，但具體作用機制尚需進一步研究明確。

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2016-10-17)