脂聯素對老化骨髓間充質干細胞自發性骨化的影響

劉金山，李迪，武首先

(內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古通遼028000)

脂聯素對老化骨髓間充質干細胞自發性骨化的影響

劉金山，李迪，武首先

(內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古通遼028000)

目的 探討老化骨髓間充質干細胞(BMSCs)的自發性骨化過程及脂聯素在這一過程中的作用。方法 將第2代BMSCs(分離自一小兒畸形斷肢的殘指)分為空白對照組及脂聯素低、中、高劑量組。空白對照組加入DMEM/F12培養基及10%胎牛血清，脂聯素低、中、高劑量組分別在此基礎上加入終濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂聯素，各組均傳代培養至第10代。收集各組第2代和第10代細胞，茜素紅S染色后計算鈣化物染色率，qPCR法檢測骨鈣素(OCN)mRNA相對表達量。結果 與第2代細胞比較，各組第10代細胞鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達量均升高(P均<0.05)；與空白對照組第10代細胞比較，脂聯素低、中、高劑量組鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達量均升高，但脂聯素中、高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。結論 BMSCs在傳代過程中可發生自發性骨化，脂聯素可促進這一過程，并呈濃度依賴性。

骨髓間充質干細胞；脂聯素；骨鈣素；成骨分化；細胞傳代

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種具有自我更新和分化潛能的成體干細胞，可分化為多種成熟細胞。BMSCs可修復受損的骨組織，在維持骨組織代謝平衡過程中具有重要作用[1～3]。近年研究發現，BMSCs的分化能力具有在傳代過程中逐漸減弱的趨勢，且伴有自發性成骨的發生，其作用機制尚不明確[4]。脂聯素是近年來新發現的脂肪細胞因子之一，具有增強機體對胰島素的敏感性、抗炎、促進骨發育和抗動脈粥樣硬化等生物學活性，在調節機體糖類和脂類代謝中具有重要作用[5]。研究發現，骨外傷患者體內脂肪細胞因子含量明顯升高，且與患者的年齡相關[6，7]。2016年2～5月，本研究通過多次傳代構建老化的BMSCs模型，觀察了脂聯素在誘導老化BMSCs自發性骨化過程中的作用。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：QuantiTect Probe RT-PCR Kit試劑盒購自德國凱杰公司，茜素紅S染色試劑盒購自上海中喬新舟生物科技有限公司，0.25%EDTA胰酶購自美國Hyclone公司，TRIzol和α-MEM培養基購自美國GE公司，CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD29-PE、CD44-FITC、CD105-APC購自美國BD公司；脂聯素購自美國Sigma-Aldrich有限公司；分析純試劑購自國藥集團北京分公司；二抗購自中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器：細胞培養箱購自美國熱電公司，Allegra 64R低溫高速離心機、CytoFLEX流式細胞儀購自德國Beckman公司，CX51熒光倒置顯微鏡購自日本奧林帕斯公司，MyCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 BMSCs分離及鑒定 經患者本人及其家屬同意，經我院倫理委員會批準，取我院骨外科一小兒畸形斷肢的殘指，于超凈工作臺中反復使用75%乙醇消毒。手術刀分離斷肢的肌肉、肌腱，取出殘肢內的指骨，用咬骨剪剪斷指骨兩端。注射器抽取含10%胎牛血清的α-MEM培養基20 mL，從指骨一端反復沖洗骨髓腔，并將液體收集于50 mL離心管中。PBS沖洗，1 500 r/min離心5 min，取細胞懸液用含10%胎牛血清的α-MEM培養基培養3天，半量換液。培養第7天時，顯微鏡下觀察BMSCs生長情況，取貼壁生長的細胞進行消化并傳代。取消化下來的部分BMSCs，1 500 r/min離心5 min，棄除培養基；使用PBS清洗2次后重懸，并調整細胞密度為1×106個/mL，制備單細胞懸液。取200 μL單細胞懸液，分別加入CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD29-PE、CD44- FITC、CD105-APC不同類型的流式抗體5 μL，避光室溫孵育15 min，上流式細胞儀檢測CD45、CD34、HLA-DR、CD29、CD44和CD105在BMSCs中的表達。以陽性表達率>99%定義為陽性，<1%定義為陰性。結果顯示，細胞表面CD45、CD34、HLA-DR表達均為陰性，CD29、CD44、CD105表達均為陽性，證實分離的細胞為BMSCs。

1.3 細胞分組處理 將BMSCs用0.1%胰酶消化后，接種到25 cm2培養瓶中，原代培養至第7 天(第2代)。將第2代BMSCs分為空白對照組及脂聯素低、中、高劑量組。空白對照組加入DMEM/F12培養基及10%胎牛血清，脂聯素低、中、高劑量組分別在此基礎上加入終濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂聯素。將細胞按照1∶3的比例每3 天傳代1次，保持脂聯素在各組培養基中的濃度，融合至90%后進行傳代，傳至第10代。

1.4 BMSCs自發性骨化及脂聯素對自發性骨化影響的觀察

1.4.1 細胞鈣化情況 取各組原代細胞培養至第2代和傳代培養至第10代的細胞，分別行茜素紅S染色。方法如下：將細胞用PBS沖洗兩遍，4%多聚甲醛固定10 min；PBS繼續沖洗兩遍，加入茜素紅S染液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗兩遍。嚴格按照茜素紅S染色試劑盒說明書進行操作。40倍顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況(茜素紅)可將鈣化物染成紅色，隨機選取10個視野，采用Image Pro Plus6.0軟件分析鈣化物面積。鈣化物染色率=茜素紅S染色面積/低倍鏡視野總面積×100%。實驗重復5次。

1.4.2 細胞骨鈣素(OCN)mRNA表達 采用qPCR法。取各組原代培養至第2代和傳代培養至第10代的細胞，TRIzol裂解后提取總RNA，合成cDNA后，對MIB2和內參基因GAPDH mRNA進行實時定量PCR擴增。PCR反應體系20 μL：上、下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 0.5 μL，SYBR綠色熒光染料10 μL。PCR反應條件：95 ℃、3 min，循環1次；95 ℃、12 s，62 ℃、60 s，循環35次；62～95 ℃，每2 s升高0～2 ℃，循環1次。OCN引物序列：上游引物：5′-TGCAAAGCCCAGCGACTCT -3′，下游引物：5′-AGTCCATTGTTGAGGTAGGG-3′，引物長度：20 bp；GAPDH引物序列：上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′，引物長度：19 bp。采用2-ΔΔCt法計算OCN mRNA相對表達量。實驗重復6次。

2 結果

2.1 各組細胞鈣化物沉積情況比較 與第2代細胞比較，各組第10代細胞鈣化物染色率均升高(P均<0.05)；與空白對照組第10代細胞比較，脂聯素低、中、高劑量組鈣化物染色率均升高，但脂聯素中、高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組鈣化物染色率比較

注：與同組第2代比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05；與脂聯素低劑量組比較，△P<0.05。

2.2 各組OCN mRNA相對表達量比較 與第2代細胞比較，各組第10代細胞OCN mRNA相對表達量均升高(P均<0.05)；與空白對照組第10代細胞比較，脂聯素低、中、高劑量組OCN mRNA相對表達量均升高，但脂聯素中、高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組OCN mRNA相對表達量比較

注：與同組第2代比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05；與脂聯素低劑量組比較，△P<0.05。

3 討論

骨形成在人體發育過程中具有一定規律性：在青年期以前，骨可以由骺軟骨逐漸骨化形成；而成年期以后，骨的來源主要依靠成骨細胞和破骨細胞在骨組織內的代謝平衡完成[8]。BMSCs作為已知成骨細胞的主要來源，在骨細胞的自我更新過程中發揮重要作用。但是隨著傳代數量的增加，BMSCs的分化和增殖能力逐漸改變，可以發生自發性骨化和自發性脂肪化等不同現象，其原因目前尚不明確。

脂肪細胞因子是上世紀80年代發現的由脂肪細胞分泌的補體因子，最初是由Friedman研究組在1994年首先克隆出肥胖基因的表達產物——瘦素，從而開啟了脂肪細胞因子的新時代[10]。隨后脂肪細胞因子家族中的其他成員逐漸被發現，包括脂聯素、抵抗素、TNF-α和IL-6等，目前已經確認的脂肪細胞因子有20多種。脂聯素是由體內脂肪組織和脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子之一，其基因定位于染色體3q27，蛋白質分子量為30 kDa，由244個氨基酸組成，在人體血液中以三聚體、六聚體和多聚體的形式微量存在，其濃度為2～25 mg/L，在女性血液中的含量較男性高[11，12]。脂聯素在調節機體糖類和脂類代謝中發揮重要作用，其在體內可以通過激活AMPK、PPAR-α和p38MAPK等信號通路，發揮增強機體對胰島素的敏感性、抗炎、促進骨發育和抗動脈粥樣硬化等生物學活性[13，14]。研究顯示，骨外傷患者體內脂肪細胞因子含量明顯增高，推測脂肪細胞因子可能與骨組織的修復有關[9]；老年人在骨折愈合的過程中體內脂聯素含量明顯升高[15]。說明脂聯素可能在骨形成的過程中發揮一定作用。

鈣化物沉積及OCN表達升高是BMSCs發生自發性骨化的特異性標志。骨骼在形成的過程中，鈣化物不斷沉積在骨小梁表面，是形成骨密質的主要成分。因此，鈣化沉積可以反映出骨組織的形成情況。OCN是成骨細胞特異分泌的一種蛋白質，可促進骨骼的鈣化過程，被認為是骨組織形成過程中的重要標志蛋白之一。本研究結果顯示，各組第2代細胞鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義，這是由于在BMSCs分化的早期，細胞增殖能力較強而分化能力相對較弱，因此并未出現分化現象。本研究各組第10代細胞鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達量均明顯高于第2代細胞，說明BMSCs在傳代過程中分化能力增強，發生了自發性骨化。本研究第10代細胞脂聯素低、中、高劑量組鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達量均高于空白對照組，但脂聯素中、高劑量組升高更明顯，說明脂聯素可促進BMSCs在傳代過程中的自發性骨化過程，并呈濃度依賴性。

本研究結果有助于揭示BMSCs自發性骨化的機制，為臨床骨代謝過程的研究提供依據。通過監測骨質疏松患者血液中脂聯素水平， 并分析其骨代

謝情況，在預防老年性骨質疏松等方面具有一定的參考價值。

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內蒙古自治區教育廳科技計劃項目(NJZY173)。

武首先(E-mail: wushouxian@yeah.net)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.012

R329

A

1002-266X(2017)16-0041-03

2016-10-11)