2型糖尿病患者腸道菌群變化及意義

馬蘇嫻，張銳銳，王蘇，鄧家良，楊祿，袁國躍

(1江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212001；2天益健康科學研究院)

2型糖尿病患者腸道菌群變化及意義

馬蘇嫻1，張銳銳2，王蘇1，鄧家良1，楊祿2，袁國躍1

(1江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212001；2天益健康科學研究院)

目的 探討2型糖尿病(T2DM)患者腸道菌群變化的臨床意義。方法 選取8例T2DM患者與10例體檢健康者，提取其糞便基因組DNA，應用菌屬16S rRNA V4序列特異性引物，采用高通量測序技術分析腸道菌群多樣性(以香農多樣性指數表示)及種類(以豐度表示)。觀察不同性別T2DM患者的腸道菌群種類差異，分析T2DM患者腸道優勢菌屬與空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(1 h PG)和餐后2 h血糖(2 h PG)的關系。結果 T2DM患者與體檢健康者香農多樣性指數分別為3.70±0.29、3.30±0.20，二者比較P>0.05。門水平下T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，二者上述4種優勢菌門豐度比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。屬水平下T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優勢菌屬為擬桿菌屬和毛螺桿菌科，體檢健康者羅斯氏菌屬豐度高于T2DM患者(P<0.05)。女性T2DM患者擬桿菌屬科豐度高于男性患者，假單胞菌屬豐度低于男性患者(P均<0.05)。T2DM患者柔嫩梭菌屬豐度與2 h PG呈正相關(r=0.75，P<0.05)，其他腸道優勢菌屬與FPG、1 h PG、2 h PG均無關(P均>0.05)。結論 T2DM患者腸道內存在菌群失調，并具有性別差異；柔嫩梭菌屬與血糖水平有關，可為T2DM的治療提供一種新的思路。

2型糖尿病；腸道菌群；腸道優勢菌屬；豐度；血糖；高通量測序

研究發現，2型糖尿病(T2DM)的發生不僅與人類基因組差異、飲食結構改變及運動量減少有關，亦與腸道菌群改變有關[1]。T2DM患者多伴有糖脂代謝紊亂，而腸道菌群與宿主之間在調節能量平衡方面聯系密切。高通量測序技術多用于檢測腸道菌群的結構及多樣性，具有快速、準確等特點[2]。本研究采用高通量測序技術觀察T2DM患者的腸道菌群結構及多樣性變化，現分析結果并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年9月江蘇大學附屬醫院收治的T2DM患者8例，男4例、女4例，年齡40～70歲?；颊呔蟇HO關于T2DM的診斷標準[2]，排除妊娠糖尿病、特殊類型糖尿病以及合并其他系統性疾病者。選擇同期體檢健康者10例，男5例、女5例，年齡40～70歲。研究對象采樣前3個月內未服用抗生素，近2周內未服用益生元、益生菌等制品，近3個月內無腹瀉、便秘、痢疾等胃腸道疾病。

1.2 腸道菌群檢測 采用高通量測序技術。受試者于環境溫度不高于10 ℃的條件下，采集潔凈糞便于儲存盒內，并進行密封。于2級生物安全柜內稱取0.25 g糞便樣本，2 h內送到實驗室。采用PowerSoil?-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit提取試劑盒(美國MoBio公司)，根據試劑盒說明書提取糞便基因組DNA，檢測其質量合格后于-20 ℃保存。利用帶有barcode的特異性引物擴增16S rDNA的V4區域，并進行精確定量和純化回收。構建好的文庫經過精確定量和Agilent 2200質檢合格后，采用Illumina v3 kit(2×300)于MiSeq(美國Illumina公司)上機檢測腸道菌群。方法如下：采用微生物16S rRNA分析管道(QIIME)將優質序列聚類成操作分類單元(OTUs)，并對所有樣品的優質序列按0.97的相似度進行OTUs聚類，選取每一類中最長的序列作為其代表序列。采用RDP-classifier對OTUs代表序列進行注釋，得到每個OTUs的分類學信息。統計各個樣品中的OTUs分類數量，應用Mothur軟件(version 1.36.0) 計算針對單個樣品物種多樣性分析的香農多樣性指數。香農多樣性指數越大，說明樣品中的物種越豐富[3]。于門水平及屬水平下對OTUs數據進行匯總，并計算門水平和屬水平下的菌群豐度(即該菌群在總體菌群中的比例，以百分率表示)。對不同性別T2DM患者的OTUs進行分類匯總，計算腸道菌群豐度。記錄T2DM患者的腸道優勢菌屬，分析其豐度與患者空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(1 h PG)和餐后2 h血糖(2 h PG)的關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料以四分位數法表示，結果比較采用Mann-WhitneyU檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OTUs分類數量及多樣性 T2DM患者與體檢健康者OTUs分類數量分別為447.50±36.78、386.60±15.26，香農多樣性指數分別為3.70±0.29、3.30±0.20，二者比較P均>0.05。

2.2 門水平下的腸道菌群結構 門水平下T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，二者上述4種優勢菌門豐度比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 T2DM患者和體檢健康者門水平下的腸道優勢菌門豐度[M(P25,P75)]

2.3 屬水平下的腸道菌群結構 屬水平下T2DM患者的腸道優勢菌屬為擬桿菌屬、毛螺桿菌科、瘤胃球菌科和埃希氏菌屬等，體檢健康者的腸道優勢菌屬為普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、毛螺桿菌科和Blautia等。擬桿菌屬和毛螺桿菌科是T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優勢菌屬，體檢健康者羅斯氏菌屬豐度高于T2DM患者(P<0.05)。見表2。

2.4 不同性別T2DM患者的腸道菌群結構 男性T2DM患者的腸道優勢菌群為擬桿菌屬、瘤胃球菌科、毛螺桿菌科、埃希氏菌屬、梭菌目、普雷沃氏菌屬等，女性患者的腸道優勢菌群為擬桿菌屬、毛螺桿菌科、埃希氏菌屬等。擬桿菌屬、毛螺桿菌科和埃希氏菌屬為男女性T2DM患者的腸道共同優勢菌群。女性T2DM患者擬桿菌屬豐度高于男性患者，假單胞菌屬豐度低于男性患者(P<0.05)。見表3。

2.5 T2DM患者血糖與腸道優勢菌屬豐度的關系 T2DM患者柔嫩梭菌屬豐度與2 h PG呈正相關(r=0.75，P<0.05)，與FPG、1 h PG均無關(P均>0.05)。T2DM患者其他腸道優勢菌屬豐度與FPG、1 h PG、2 h PG均無關(P均>0.05)。見表4。

表2 T2DM患者和體檢健康者屬水平下的腸道優勢菌屬豐度比較[M(P25,P75)]

表3 不同性別T2DM患者的腸道菌群豐度比較[M(P25,P75)]

3 討論

腸道菌群是人體微環境的重要組成部分， 也是最大、最復雜的微生態系統，其多樣性可能是宿主和腸道菌群之間強烈選擇和協同進化的結果[4]。腸道中的正常菌群能夠為宿主提供或合成一些營養要素，如B族維生素、葉酸、生物素等[5]。隨著研究的深入，人們逐漸發現，腸道菌群不僅與營養相關，也與人體健康和疾病發生有著極為密切的聯系。腸道正常菌群與腸黏膜緊密結合，構成腸道的生物屏障，能夠通過營養競爭、占位效應及其代謝產物等抑制條件致病菌的過度生長和外來致病菌的入侵，從而維持腸道菌群平衡[6]。研究表明，腸道菌群與肥胖[7，8]、糖尿病[9]、心腦血管疾病[10，11]和腫瘤[12]等疾病的發生密切相關。

表4 T2DM患者血糖相關指標與腸道優勢菌屬豐度的關系

注：*P<0.05。

目前臨床采用傳統培養法培養的細菌僅占腸道菌群的1%～10%，并不能反映菌群的多樣性[13]；變性梯度凝膠電泳、熒光定量PCR技術也只能檢測出一定豐度以上的細菌或特定微生物[14，15]。高通量測序技術又稱下一代測序技術，是在第一代Sanger測序基礎上發展而來的新興測序技術，能夠一次性對高達數百萬條的DNA序列進行測定，使得對菌群進行全面細致的分析成為可能。以Illumina為測序平臺的測序技術在研究人類腸道宏基因組方面發揮重要作用[5，16]。與傳統培養方法和變性梯度凝膠電泳等分子生物學方法不同，高通量測序技術能更全面地反映微生物群體的物種組成、分布及豐度信息。

Karlsson等[17]研究發現，糖尿病患者腸道菌群的結構、功能與血糖、糖耐量異常均有關。 Larsen等[18]研究發現，與正常人相比，T2DM患者糞便中β-變形菌豐度明顯升高，擬桿菌門與硬壁菌門的比值以及普氏擬桿菌與腸球菌的比值與血糖水平呈正相關。本研究發現，T2DM患者與健康人群門水平的4種優勢菌門豐度比較差異均無統計學意義；但T2DM患者屬水平腸道菌群的豐度與健康人群存在一定的差異，尤其是可以產生丁酸的羅斯氏菌屬豐度顯著低于健康人群。丁酸是腸道上皮細胞重要的能量來源，菌羅斯氏菌、Blautia屬、假丁酸弧菌屬和柔嫩梭菌都是人腸道內重要的丁酸產生菌。Qin等[19]研究發現，丁酸產生菌是區別健康人群與T2DM患者的重要菌群。本研究還發現，T2DM患者柔嫩梭菌屬豐度與2 h PG呈正相關，進一步驗證了上述結論。本研究女性T2DM患者腸道中的優勢菌屬明顯少于男性患者，擬桿菌屬豐度高于男性患者，假單胞菌屬豐度低于男性患者，說明男女性T2DM患者的腸道菌群存在差異。以上結果均提示，腸道菌群在T2DM的發生、發展中具有一定作用，但是具體機制尚不清楚；雖然男女性T2DM患者血糖均升高，但其升高的機制可能存在差異。本研究T2DM患者門水平下變形菌門豐度有高于健康人群的趨勢，屬水平下Blautia和假丁酸弧菌屬豐度有低于健康人群的趨勢，擬桿菌屬和埃希氏菌屬豐度有高于健康人群的趨勢，但均無統計學差異，可能與本研究納入例數較少有關，仍需擴大樣本進一步驗證。

綜上所述，T2DM患者腸道內存在菌群失調，并具有性別差異；柔嫩梭菌屬與血糖水平有關，可為T2DM的治療提供一種新的思路。

[1] Cani PD, Geurts L, Matamoros S, et al. Glucose metabolism: focus on gut microbiota, the endocannabinoid system and beyond [J]. Diabetes Metab, 2014,40(4):246-257.

[2] Haraszthy VI, Zambon JJ, Sreenivasan PK, et al. Identification of oral bacterial species associated with halitosis [J]. J Am Dent Assoc, 2007,138(8):1113-1120.

[3] Kemp PF, Aller JY. Bacterial diversity in aquatic and other environments: what 16s rdna libraries can tell us[J] . FEMS Microbiol Ecol, 2004,47(2):161-177.

[4] Isberg RR, Barnes P. Dancing with the host; flow-dependent bacterial adhesion[J]. Cell, 2002,110(1):1-4.

[5] Hooper LV, Midtvedt T, Gordon JI. How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine[J]. Annu Rev Nutr, 2002(22):283-307.

[6] 王友湘,陳慶森.益生菌和腸道黏膜免疫關系的研究進展[J].食品科學,2007,28(8):537-542.

[7] Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T, et al. A core gut microbiome in obese and lean twins[J]. Nature, 2009,457(7228):480-484.

[8] Ley RE. Obesity and the human microbiome[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2010,26(1):5-11.

[9] Markle JG, Frank DN, Mortin-Toth S, et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity[J]. Science, 2013,339(6123):1084-1088.

[10] Wang Z, Klipfell E, Bennett BJ, et al. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease[J]. Nature, 2011,472(7341):57-63.

[11] Collins SM, Surette M, Bercik P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain[J]. Nat Rev Microbiol, 2012,10(11):735-742.

[12] Fox JG, Feng Y, Theve EJ, et al. Gut microbes define liver cancer risk in mice exposed to chemical and viral transgenic hepatocarcinogens[J]. Gut, 2010,59(1):88-97.

[13] Stewart CJ, Marrs EC, Magorrian S, et al. The preterm gut microbiota: changes associated with necrotizing enterocolitis and infection[J]. Acta Paediatr, 2012,101(11):1121-1127.

[14] Smith B, Bode S, Skov TH, et al. Investigation of the early intestinal microflora in premature infants with/without necrotizing enterocolitis using two different methods[J]. Pediatr Res, 2012,71(1):115-120.

[15] Madan JC, Salari RC, Saxena D, et al. Gut microbial colonisation in premature neonates predicts neonatal sepsis[J] . Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 2012,97(6):456-462.

[16] Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature, 2010,464(7285):59-65.

[17] Karlsson FH, Tremaroli V, Nookaew I, et al. Gut metagenome in european women with normal, impaired and diabetic glucose control[J]. Nature, 2013,498(7452):99-103.

[18] Larsen N, Vogensen FK, van den Berg FW, et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults[J]. PLoS One, 2010,5(2):e9085.

[19] Qin J, Li Y, Cai Z, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J]. Nature, 2012,490 (7418):55-60.

Variation of intestinal flora in patients with type 2 diabetes mellitus and the significance

MASuxian1,ZHANGRuirui,WANGSu,DENGJialiang,YANGLu,YUANGuoyue

(1AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China)

Objective To detect the variation of intestinal flora in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and the clinical significance. Methods The fecal samples were collected from 8 T2DM patients and 10 healthy participants. Total DNA was extracted from stool samples and submitted to high-throughput sequencing with primers targeting V4 region of the 16s rRNA gene. High-throughput sequencing was used to analyze the abundance and diversity of fecal microbiota. The difference of intestinal flora in patients with different gender, and the relationship between the dominant bacteria in the T2DM patients and fasting plasma glucose (FPG), 1 hour postprandial blood glucose (1h PG) and 2 hour postprandial blood glucose (2h PG) were investigated. Results The Shannon diversity index of T2DM patients and healthy subjects was 3.70±0.29 and 3.30±0.20, respectively, and there was no significant difference between the two groups (P>0.05). The dominant bacteria in the two groups were Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Actinobacteria at phylum level, and there was no significant difference in the abundance between the two groups (allP>0.05). In addition, the dominant bacteria were Bacteroides and Lachnospiraceae in the two groups at genus level. Compared with healthy subjects, the abundance of Roseburia was significantly reduced in the T2DM patients (P<0.05). The abundance of the Bacteroides in the female T2DM patients was much higher than that of the male patients, while the abundance of Peptostreptococcaceae was much lower than that of the male patients (P<0.05). The abundance of Faecalibacterium was positively correlated with 2 h PG (r=0.75,P<0.05), and the other dominant bacteria were not correlated with FPG, 1 h PG, 2 h PG (allP>0.05). Conclusion T2DM patients show intestinal flora imbalance with gender differences, and the abundance of Faecalibacterium in T2DM patients is related to blood glucose, which may provide a new therapeutic approach for T2DM.

type 2 diabetes mellitus; intestinal flora; intestinal dominant fungi; abundance; blood glucose; high-throughput sequencing

國家自然科學基金面上項目(81570721、81370965)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK20151331)；“六大人才高峰”第十二批高層次人才項目(2015-WSN-006)；鎮江市科技支撐-社會發展重點項目(SH2015028)。

馬蘇嫻(1991-)，女，碩士研究生在讀，研究方向為內分泌代謝性疾病的診斷與治療。E-mail: 839282375@qq.com

袁國躍(1971-)，男，主任醫師，研究方向為內分泌代謝性疾病的診斷與治療。E-mail: yuanguoyue@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.006

R587.1

A

1002-266X(2017)16-0020-04

2016-07-15)