雷帕霉素聯合阿霉素對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響及其機制

崔明星，詹新立，劉沖，鄧黎，熊春翔，劉會江

(1新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉453100；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

雷帕霉素聯合阿霉素對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響及其機制

崔明星1，詹新立2，劉沖2，鄧黎2，熊春翔2，劉會江2

(1新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉453100；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

目的 探討雷帕霉素聯合阿霉素對人骨肉瘤MG-63細胞(以下稱骨肉瘤細胞)增殖的影響及其作用機制。方法 取對數生長期骨肉瘤細胞，分別加入不同濃度的阿霉素(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L)和雷帕霉素(20、50、100 nmol/L)單獨及聯合作用，采用MTT法檢測作用48 h的細胞增殖抑制率，并計算兩藥相互作用指數(CDI)，評價兩藥相互作用性質。結果以100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯合作用后的細胞增殖抑制率最高，此時CDI<0.7，兩種藥物表現為顯著協同作用。將對數生長期的骨肉瘤細胞分為五組，阿霉素組、雷帕霉素組分別加入0.5 mg/L阿霉素、100 nmol/L雷帕霉素，聯合用藥組加入0.5 mg/L阿霉素和100 nmol/L雷帕霉素，DMSO溶媒組加入等量DMSO，空白對照組不予處理。采用MTT法檢測各組細胞增殖能力，連續記錄5天。采用Real-time PCR法檢測各組處理48 h缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2) mRNA 相對表達量。結果 各組作用第1、2天細胞增殖能力比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。作用第3～5天，聯合用藥組細胞增殖能力均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組及雷帕霉素組(P均<0.05)。聯合用藥組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達量均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組、雷帕霉素組(P均<0.05)。結論 雷帕霉素聯合阿霉素可以協同抑制骨肉瘤細胞增殖；降低HIF-1α、VEGF、MMP-2表達可能是其作用機制。

骨肉瘤；細胞增殖；雷帕霉素；阿霉素；藥物敏感性

骨肉瘤是一種好發于長骨干骺端的原發性惡性腫瘤，在青少年人群中多發。骨肉瘤發病機制尚不十分清楚，患者的5年生存率為60%～75%[1]，超過30%的患者發生遠處轉移?；诎⒚顾氐穆摵匣煼桨笧槟壳肮侨饬龅闹饕委煼椒?，但阿霉素的耐藥問題卻大大降低了其臨床效果。研究發現，雷帕霉素可特異性阻斷mTOR信號通路，從而發揮抑制骨肉瘤細胞增殖的作用[2,3]。但關于雷帕霉素聯合阿霉素對骨肉瘤細胞增殖的影響及其相關機制的研究鮮見報道。為此，我們于2012年9月～2014年3月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人骨肉瘤細胞株MG-63(以下稱骨肉瘤細胞)購自中國科學院昆明細胞庫。主要試劑及儀器：DMEM高糖培養液、阿霉素購自美國Gibco公司，雷帕霉素購自美國Gene Operation公司，二甲亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，逆轉錄試劑盒與Real-time PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。7500型實時熒光定量分析系統購于美國ABI公司。

1.2 雷帕霉素與阿霉素的聯合作用觀察

1.2.1 細胞培養及干預 將骨肉瘤細胞置于含10%滅活胎牛血清、10 000 U/mL青霉素和10 000 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養，根據培養瓶中的細胞生長情況，2～3天更換一次培養液。將對數期生長的骨肉瘤細胞接種于96孔培養板，調整細胞密度為2×104個/mL，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養12 h。待細胞貼壁后，分別加入0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L阿霉素與20、50、100 nmol/L雷帕霉素單獨及聯合作用，每孔終體積為200 μL，每個濃度設3個復孔。

1.2.2 雷帕霉素和阿霉素濃度篩選 藥物作用48 h，于全自動酶標儀570 nm波長處測定各孔光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(樣品組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。結果顯示，在相同阿霉素濃度下，隨著雷帕霉素濃度的升高，兩藥聯合應用后骨肉瘤細胞增殖抑制率呈升高趨勢(P均<0.05)。以100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯合作用后對骨肉瘤細胞的增殖抑制率最高(上述濃度用于以下研究)。見表1。

表1 骨肉瘤細胞經阿霉素、雷帕霉素單獨與聯合作用后的細胞增殖抑制率

1.2.3 藥物作用性質判斷 采用相互作用指數(CDI)評價兩藥相互作用性質。CDI=AB/(A×B)。AB為阿霉素和雷帕霉素聯合作用時與空白對照細胞OD值的比值；A、B為阿霉素或雷帕霉素單獨作用時與空白對照細胞OD值的比值。CDI<1說明兩藥具有協同作用，CDI<0.7說明兩藥協同作用非常顯著，CDI=1說明兩藥具有相加作用，CDI>1說明兩藥具有拮抗作用。結果顯示，阿霉素濃度<0.5 mg/L時，兩藥聯合作用后CDI<1；其中100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯合作用后CDI<0.7。阿霉素濃度>0.5 mg/L時，兩藥聯合作用后CDI>1。見表2。

1.3 阿霉素聯合雷帕霉素對骨肉瘤細胞增殖影響的觀察

1.3.1 細胞分組及干預 將對數期生長的骨肉瘤

表2 骨肉瘤細胞經阿霉素、雷帕霉素聯合作用后的CDI

細胞接種于96孔培養板，調整細胞密度為2×104個/mL， 將細胞隨機分為空白對照組、 DMSO 溶媒組、阿霉素組、雷帕霉素組以及聯合用藥組。阿霉素組、雷帕霉素組分別加入0.5 mg/L阿霉素、100 nmol/L雷帕霉素，聯合用藥組加入0.5 mg/L阿霉素和100 nmol/L雷帕霉素，DMSO溶媒組加入等量DMSO，空白對照組不予處理。每孔終體積為200 μL，每組設3個復孔。

1.3.2 相關指標檢測

1.3.2.1 細胞增殖能力 取各組處理48 h的細胞，采用MTT法檢測各組全自動酶標儀570 nm波長處的OD值，代表細胞增殖能力。連續記錄5天。

1.3.2.2 缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2) mRNA 相對表達量 采用Real-time PCR法。取各組處理48 h的細胞，TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度及純度合格，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。采用7500型實時熒光定量分析系統，以β-actin為內參基因進行Real-time PCR反應。引物序列:HIF-1α上游引物：5′-TGCACAGGCCACATTCACG-3′，下游引物：5′-GTTCACAAATCAGCACCAA-

GC-3′；VEGF上游引物：5′-TGCTGTGGACTTGAGTTG-

GG-3′，下游引物：5′-GGCTGGGTTTGTCGGTGTT-3′；MMP-2上游引物：5′-TACAGGATCATTGGCTACACAC-

C-3′，下游引物：5′-GGTCACATCGCTCCAGACT-3′；β-actin 上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。以2-ΔΔCT法計算HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 隨著作用時間的延長,各組細胞增殖能力逐漸升高。各組作用第1、2天細胞增殖能力比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。作用第3～5天，聯合用藥組細胞增殖能力均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組及雷帕霉素組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細胞增殖能力比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與DMSO溶媒組比較，#P<0.05；與阿霉素組比較，△P<0.05；與雷帕霉素組比較，▽P<0.05。

2.2 各組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA 相對表達量比較 阿霉素組、雷帕霉素組及聯合用藥組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達量均低于空白對照組及DMSO溶媒組，但聯合用藥組降低更明顯(P均<0.05)。見表4。

表4 各組HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與DMSO溶媒組比較，#P<0.05；與阿霉素組比較，△P<0.05；與雷帕霉素組比較，▽P<0.05。

3 討論

雷帕霉素是36元環含氮三烯大環內酯類抗菌藥物，廣泛用于器官移植術后的抗排斥反應。雷帕霉素通過抑制mTOR蛋白的激酶活性，發揮抗菌、免疫抑制和抗腫瘤作用。mTOR是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。在細胞中，mTOR以mTORC1和mTORC2的催化亞基形式存在，其活性調控機制比較復雜，受多種調節信號蛋白參與，其中最主要的是PI3K/Akt/mTOR和Akt/TSC1-TSC2/mTOR/S6K通路。

近年研究發現，雷帕霉素可通過對腫瘤細胞mTOR通路的作用，發揮抑制骨肉瘤細胞增殖和誘導其凋亡的作用[4～6]。Campone等[7]建立了一個對阿霉素耐藥的、以Akt通路為主要存活機制的B細胞淋巴瘤小鼠模型，通過雷帕霉素抑制Akt活性，使腫瘤細胞恢復對阿霉素的敏感性。徐國才等[8]報道，雷帕霉素通過誘導腫瘤細胞的自噬，促進其凋亡發生，進而提高對順鉑的敏感性。雷帕霉素聯合順鉑作用于喉癌Hep-2細胞時，可明顯提高其細胞凋亡率，表明二者存在明顯的協同作用[9]。本研究結果顯示，在相同阿霉素濃度下，隨著雷帕霉素濃度的升高，兩藥聯合應用后骨肉瘤細胞增殖抑制率呈升高趨勢；以100 nmol/L雷帕霉素與0.5 mg/L 阿霉素聯合作用后對骨肉瘤細胞的增殖抑制率最高，此時CDI<0.7，兩種藥物表現為顯著協同作用。表明雷帕霉素可增強骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性，兩藥聯合具有協同作用。

HIF-1α被認為是腫瘤缺氧適應性反應的中心啟動因子，是惟一可以決定HIF-1活性的氧調節亞基，通過直接或者間接調控多種靶基因的表達，使腫瘤細胞對缺氧產生生理適應，并參與腫瘤的生長、浸潤和轉移等生物學行為。Zhang等[10]發現，抑制HIF-1α表達可明顯抑制乳腺癌原發灶的生長，并減少轉移到肺組織的腫瘤細胞。腫瘤細胞可以合成、分泌VEGF，在腫瘤組織中的表達水平高于正常組織。研究表明，抑制VEGF表達可以對腫瘤新生血管、淋巴管的形成以及腫瘤的發生、發展、轉移產生明顯的抑制作用[11～14]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一種幾乎能降解細胞外基質中各種蛋白成分的酶，可破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲和轉移中起關鍵性作用。Park等[15]報道，通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路可下調MMP-2基因的轉錄及翻譯。本研究結果顯示，各組作用第3～5天，聯合用藥組細胞增殖能力及HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達量均明顯低于空白對照組、DMSO溶媒組、阿霉素組、雷帕霉素組。說明雷帕霉素聯合阿霉素可抑制骨肉瘤細胞的增殖，其機制可能與抑制HIF-1α、VEGF、MMP-2 mRNA表達有關。

綜上所述，雷帕霉素可增強骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性；抑制HIF-1α、VEGF、MMP-2表達可能是其作用機制。mTOR信號通路在體內廣泛存在，雷帕霉素聯合阿霉素提高骨肉瘤細胞靶向特異性的具體機制仍有待進一步研究。本研究的不足是未從細胞周期及蛋白水平等方面進行深入研究。

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Effects of Rapamycin and Adriamycin on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

CUIMingxing1,ZHANXinli,LIUChong,DENGLi,XIONGChunxiang,LIUHuijiang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China)

Objective To investigate the effects of Rapamycin (RAPA) and Adriamycin (ADM) on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells and their mechanisms. Methods Human osteosarcoma MG-63 cells in logarithmic growth phase was treated with ADM solution of different concentrations (0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L) and RAPA solution of different concentrations (20, 50, 100 nmol/L) alone or in combination. Then the cell inhibition rate was determined by MTT after 48 hours, and Coefficient of drug interaction (CDI) was calculated to evaluate the nature of the interaction between the two drugs. The cell inhibition rate was the highest when MG-63 cells were treated with 100 nmol/L RAPA combined with 0.5 mg/L ADM. At this moment, CDI was less than 0.7 and the two drugs showed a significant synergistic effect. According to the optimal combination concentration, we randomly divided MG-63 cells in logarithmic growth phase into five groups: ADM group (treated with 0.5 mg/L ADM), RAPA group (treated with 100 nmol/L RAPA), the combination group (treated with 0.5 mg/L ADM and 100 nmol/L RAPA), DMSO solvent group (treated with the same concentration of DMSO) and the blank control group (without any treatment). The cell proliferation ability was detected by MTT for 5 days. The expression levels of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) mRNA were analyzed by real-time PCR at 48 h. Results There was no significant difference in cell proliferation ability among these groups on day 1 and 2 (allP>0.05). The cell proliferation ability of the combination group was lower than those of the blank control group, DMSO solvent group, ADM group and RAPA group on day 3-5 (allP<0.05). The relative expression of HIF-1α, VEGF and MMP-2 mRNA in the combination group was significantly lower than that in the blank control group, DMSO solvent group, ADM group and RAPA group (allP<0.05). Conclusion RAPA combined with ADM may synergistically inhibit the proliferation of human osteosarcoma MG-63 cells by decreasing the expression of HIF-1α, VEGF, MMP-2 mRNA.

osteosarcoma; cell proliferation; Rapamycin; Adriamycin; drug sensitivity

廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA05314、2014GXNSFAA118173)；廣西高?？茖W技術研究項目(YB2014073)。

崔明星(1988-)，男，住院醫師，研究方向為骨外科疾病的診斷與治療。E-mail： cuimingxing1226@163.com

詹新立(1968-)，男，主任醫師、教授、博士生導師，研究方向為脊柱骨科疾病的診斷與治療。E-mail： 3cstar@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.003

R738.1

A

1002-266X(2017)16-0008-04

2016-06-30)