油棕乙酰CoA羧化酶（ACC）基因的鑒定與表達(dá)分析

肖勇　雷新濤　王永　曹紅星　石鵬　金龍飛　夏薇

摘要[目的]對油棕乙酰CoA羧化酶（ACC）基因進(jìn)行鑒定與表達(dá)分析。[方法]采用生物信息學(xué)方法鑒定油棕的ACC基因，并應(yīng)用擬南芥的ACC基因蛋白質(zhì)序列比對油棕的蛋白質(zhì)庫，應(yīng)用已有油棕轉(zhuǎn)錄組信息，研究ACC基因在不同組織中的表達(dá)情況。[結(jié)果]在油棕中鑒定了2個(gè)ACC基因，命名為EgACC1和EgACC2。EgACC1不含內(nèi)含子，而EgACC2含有32個(gè)內(nèi)含子；EgACC1在不同組織中都沒有表達(dá)，而EgACC2在所有組織中都有表達(dá)，其中在組培苗中有較高的表達(dá)量，同時(shí)，在油棕果發(fā)育21 d時(shí)有高的表達(dá)水平，RPKM值為70.6，為所有組織中最高。[結(jié)論]該研究闡述了油棕ACC基因的表達(dá)模式，為油棕ACC基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞油棕；ACC基因；轉(zhuǎn)錄組；RPKM

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）31-0154-02

Abstract[Objective]To study the identification and expression profile of acetyl CoA carboxylase （ACC） in Elaeis guineensis.[Method]To identify ACC genes in E.guineensis by using bioinformatics，ACC genes protein sequence of Arabidopsis thaliana were used to align with protein database of E.guineensis.The transcription group information of E.guineensis was applied to study the expression of ACC genes in different tissues.[Result] Two ACC genes were identified in the genome of E.guineensis，which were named as EgACC1 and EgACC2，respectively.Among them，EgACC1 do not contain intron，however EgACC2 contain thirty two introns.The expression of EgACC1 was not detected in different tissues of E.guineensis.However，the expression of EgACC2 was detected in all tissues.High expression levels were examined in tissue culture seedling.Meanwhile，highest expression level was detected at 21 day of mesocarp development，RPKM value was 70.6.[Conclusion]These study demonstrated that the expression pattern of ACC genes and provided basic work for functional analysis of ACC genes in E.guineensis.

Key wordsElaeis guineensis；ACC gene；Transcriptome；RPKM

油棕是重要的熱帶木本油料作物，是一種重要的熱帶木本油料作物，油棕果的含油量在50%以上，1株油棕產(chǎn)油30～40 kg，平均產(chǎn)油4 500 kg/hm2，因單位面積產(chǎn)油量高，而被稱為“世界油王”[1]。油棕的中果皮和果仁都能產(chǎn)油，其中果皮壓榨的油為棕櫚油，棕櫚油的主要成分為棕櫚酸，十六碳的飽和脂肪酸（C16∶0），而油棕果仁壓榨的油為棕櫚仁油，棕櫚仁油的脂肪酸成分類似于椰子油，其主要成分為月桂酸，十二碳的飽和脂肪酸（C12∶0）。棕櫚油脂肪酸的飽和程度非常高，不易被氧化，被認(rèn)為是奶油和反式脂肪酸的很好替代品，我國65%的棕櫚油都用于做人造奶油、起酥油、煎炸油、家庭烹調(diào)用的調(diào)和油及其他食品專用油[2]。棕櫚酸是目前世界上生產(chǎn)量、消費(fèi)量和國際貿(mào)易量最大的植物油種類，年產(chǎn)油量超過5 000萬t，2003—2004年度，我國棕櫚油消費(fèi)總量約為574.9萬t，進(jìn)口量約占世界進(jìn)口總量的13.38%，我國棕櫚油消費(fèi)主要依賴于進(jìn)口，因而培育我國棕櫚油產(chǎn)業(yè)非常重要。

脂肪酸合成的前體為乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)增加2個(gè)碳的頻率合成酰基碳鏈 [3]。ACC是脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶之一，自然界中有2種存在形式：一種為多功能酶，而另一種為多酶復(fù)合體。前者含有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，被稱為真核形式的ACC，后者可被分解多個(gè)功能蛋白，如生物素羧化酶，生物素羧基載體蛋白，羧基轉(zhuǎn)移酶和另外一個(gè)功能未知蛋白，被稱為原核形式的ACC[4-5]。

筆者應(yīng)用生物信息學(xué)，研究ACC基因的結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域，并研究不同物種ACC基因的進(jìn)化關(guān)系，分析ACC基因在油棕組織中的表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1ACC基因的鑒定

油棕的全基因組序列從NCBI（the National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站上下載，擬南芥的ACC基因從TAIR（the Arabidopsis Information Resource）網(wǎng)站上下載，為了鑒定油棕的ACC基因，將擬南芥ACC蛋白質(zhì)序列與油棕的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對，比對的E值的閾值為1e-10，將預(yù)測的油棕ACC蛋白質(zhì)序列與CDD （http：//www.ncbi.nlm.gov.cdd）和PFAM數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.sanger.ac.uk）進(jìn)行比對。

1.2ACC基因結(jié)構(gòu)分析

油棕基因組的注釋結(jié)果從NCBI（the National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站上下載，ACC基因結(jié)構(gòu)采用GSDS（the Gene Structure Display Server Programme）軟件進(jìn)行展示。

1.3ACC基因的表達(dá)分析

油棕的32個(gè)轉(zhuǎn)錄組的原始reads數(shù)據(jù)從NCBI網(wǎng)站的SRA數(shù)據(jù)庫（Sequence Read Archive）中下載，這些轉(zhuǎn)錄組分別來自于油棕的中果皮、葉子、果、花、根和莖。為了檢測ACC基因在油棕不同組織中的表達(dá)，對AAC基因RPKM值進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下：

RPKM= 106CNL/103

在該公式中，C代表比對在某一個(gè)表達(dá)基因序列上的reads的條數(shù)，N代表比對上所有表達(dá)序列的總reads數(shù)，L代表對應(yīng)的基因序列的長度[6]。

2結(jié)果與分析

2.1油棕ACC基因的鑒定從TAIR網(wǎng)站挖掘ACC基因，有2個(gè)基因?yàn)楸oA（ACC），分別為At1g36160和At1g36180。用擬南芥的這2個(gè)基因的蛋白質(zhì)序列與油棕的蛋白質(zhì)庫進(jìn)行Blastp，設(shè)定閾值為1e-10。在油棕的基因組上，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)同源基因，其中1個(gè)EgACC基因位于油棕第3染色體上， 而另外1個(gè)EgACC基因未能定在油棕的染色體上。這2個(gè)EgACC基因的長度分別為1 164和18 256 bp。序列長度較短的ACC基因命名為EgACC1，而序列較長的ACC基因命名為EgACC2。

2.2EgACC基因的結(jié)構(gòu)分析這2個(gè)基因的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示EgACC1并不含有內(nèi)含子，總基因的長度為1 164 bp，而EgACC2含有32個(gè)內(nèi)含子，外顯子最短的只有40 bp，而最長的外顯子有2 157 bp，平均每個(gè)外顯子222.75 bp。

2.3不同物種ACC基因的聚類分析下載擬南芥、油菜、油茶、花生、玉米、大豆以及油棕ACC基因的蛋白質(zhì)序列，并采用Joining Neighbour的方法，對這些蛋白質(zhì)序列進(jìn)行聚類，聚類結(jié)構(gòu)顯示：擬南芥、油茶、玉米、油茶的ACC基因聚在一塊，而油棕的ACC2和大豆的ACC2基因聚在一塊，花生的ACC與大豆ACC1基因聚在一塊，而油棕的ACC1被單獨(dú)地聚在一類。ACC2基因在所有組織中都檢測到表達(dá)量。

2.4油棕ACC基因在不同組織中的表達(dá)

下載油棕的32個(gè)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，這些轉(zhuǎn)錄組分別來自于油棕發(fā)育不同時(shí)期的中果皮、根、莖、葉、花、果。依據(jù)這些轉(zhuǎn)錄組的原始數(shù)據(jù)計(jì)算RPKM值，油棕的ACC1基因在所有組織中都沒有表達(dá)，而ACC2在不同的組織都有表達(dá)量，ACC2基因在油棕的組培苗中有高的表達(dá)量，同時(shí)在油棕果發(fā)育21 d時(shí)有高的表達(dá)水平，RPKM值為70.6，為所有組織中最高。

3討論

油棕是一種重要熱帶油料作物，因產(chǎn)油量高，而被稱為“世界油王”。油棕的基因組已被測序，測序結(jié)果顯示：油棕基因組為1.53 Gb，預(yù)測了34 802個(gè)基因，在該研究中，應(yīng)用擬南芥ACC蛋白質(zhì)序列比對油棕的蛋白質(zhì)庫，并鑒定2個(gè)油棕的ACC基因，分別命名為EgACC1和EgACC2。對這2個(gè)ACC的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯示：EgACC1不含內(nèi)含子，而EgACC2含有32個(gè)內(nèi)含子，同時(shí)，研究了這2個(gè)EgACC基因在油棕組培苗以及不同組織中的表達(dá)，同時(shí)也研究這2個(gè)ACC基因在油棕中果皮發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：EgACC1在所有組織中都沒有表達(dá)，而EgACC2在所有組織中都有表達(dá)，該基因在組培苗中有較高的表達(dá)量，同時(shí)，在油棕果發(fā)育21 d有高的表達(dá)水平，RPKM值為70.6，為所有組織中最高。

在脂類代謝的研究中，擬南芥是重要的模式植物，目前已研究了該物種中包括脂肪酸從頭合成，三酰基甘油合成和脂肪酸三酰基甘油降解等23條代謝途徑，脂肪酸合成的前體為乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶復(fù)合物（fatty acid synthetase complex，F(xiàn)AS）以丙二酸單酰CoA為底物進(jìn)行聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)2個(gè)碳的頻率合成酰基碳鏈[7]。而不斷地增加酰基碳鏈與酰基載體蛋白結(jié)合，以保護(hù)其不受代謝途徑中多種酶的侵蝕。一些研究已表明：FAS常為酮酯酰基ACP合成酶，多次反應(yīng)加碳后，脂肪酸可以在酰基ACP硫酯酶（acyl-ACP thioesterase）或酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase）的作用下終止。

ACC酶有2種形式，即多功能酶和多酶復(fù)合體，前者被稱為真核形式的ACC，而后者被稱為原核形式的ACC，原核形式的ACC可以被分為幾個(gè)多功能的亞基，即生物羧化酶、生物素羧基載體蛋白、羧基轉(zhuǎn)移酶和另一個(gè)未知功能的蛋白。在單子葉作物（ 如小麥、玉米和水稻）中的ACC酶為真核形式，這些ACC酶對aryloxy phenoxy propionates和cyclo hexane diones這2種除草劑非常敏感。但是在雙子葉植物豌豆和煙草中，ACC為原核形式。Gengenbach等[8]檢測了ACC基因在高油黃豆和低油黃豆中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，在高油黃豆中ACC基因的表達(dá)量是低油黃豆的2倍，特別是在發(fā)育的早期和中期，這些結(jié)果暗示ACC基因的表達(dá)與黃豆脂肪酸的積累具有較高的相關(guān)性。Ohlrogge等[9]將油棕種子儲藏蛋白的啟動子與擬南芥的ACC基因連接，并轉(zhuǎn)化油菜，在T1代，擬南芥的脂肪酸含量增加5.0%～6.4%。Sellwood等[10]通過反義表達(dá)技術(shù)，抑制ACC基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的含油量顯著降低。

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