右美托咪定對利多卡因致大鼠脊髓神經損傷的影響

陳戟+譚秀華+龐韜+詹鴻

[摘要] 目的 評價右美托咪定對利多卡因致大鼠脊髓神經損傷的影響。 方法 雄性SD大鼠24只，體重250～280 g，采用隨機數字表法分為三組（n=8）：對照組（C組）、利多卡因組（L組）、右美托咪定+利多卡因組（DL組）。C組僅行鞘內置管術，L組和DL組在鞘內置管后鞘內注射10%鹽酸利多卡因20 μL，其中DL組在鞘內注射利多卡因前1 h，腹腔注射右美托咪定15 μg/kg。分別于術前1 d（基礎值）及術后1、2、3 d時測定熱縮足潛伏期（TWL）。于術后3 d行為學測定結束后處死大鼠，取脊髓組織，采用TUNEL染色測定大鼠脊髓神經元細胞凋亡率，Western bolt測定脊髓腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-8（IL-8）表達水平。 結果 三組大鼠TWL基礎值比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；C組大鼠各時點TWL比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；與C組比較，L組大鼠術后1、2、3 d時TWL均延長（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠術后2、3 d時TWL均縮短（P < 0.05）。與C組比較，L組大鼠脊髓神經元細胞凋亡率升高（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓神經元細胞凋亡率降低（P < 0.05）。與C組比較，L組大鼠脊髓內TNF-α和IL-8的表達增強（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓內TNF-α和IL-8的表達減弱（P < 0.05）。 結論 右美托咪定通過抗神經元細胞凋亡減輕利多卡因所致的大鼠脊髓神經損傷，其機制與抑制炎性反應的發生有關。

[關鍵詞] 右美托咪定；利多卡因；神經損傷；凋亡；炎性因子

[中圖分類號] R741 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0022-04

Influence of Dexmedetomidine on Lidocaine-induced spinal cord never injury in rats

CHEN Ji1 TAN Xiuhua1 PANG Tao2 ZHAN Hong1▲

1.Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510150， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Family Planning Specialty Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510600， China

[Abstract] Objective To evaluate the influence of Dexmedetomidine on Lidocaine-induced spinal cord never injury in rats. Methods 24 male SD rats weighting from 250 to 280 g were divided into three groups （n=8） by random number table： control group （Group C）， Lidocaine group （Group L） and Dexmedetomidine+Lidocaine group （Group DL）. Group C was only given intrathecal cathetering， while group L and group DL were given 20 μL of 10% Lidocaine hydrochloride via intrathecal injection after intrathecal cathetering， where group DL was given 15 μg/kg of Dexmedetomidine via abdominal injection 1 h before intrathecal injection of Lidocaine. Thermal withdrawal latency （TWL） was determined on 1 d before operation （baseline） and postoperative 1， 2 and 3 d. The rats were sacrificed at the end of behavior determination at postoperative 3 d， and the spinal cord tissues were taken. TUNEL staining was used to determine the apoptosis of rat spinal neurons， and Western blot was used to determine the expressions of TNF-α and IL-8. Results There were no statistical differences among each group of rats in baseline TWL （P > 0.05）， and there were no statistical differences in baseline rat TWL in group C among different time points （P > 0.05）. Compared with group C， rat TWL of group L were all prolonger at postoperative 1， 2 and 3 d （P < 0.05）. Compared with group L. rat TWLs of group DL were all shorter at postoperative 2 and 3 d （P < 0.05）. Compared with group C， cell apoptosis rate of spinal neuron was increased and the expressions of TNF-α and IL-8 were increased in group L （P < 0.05）. Compared with group L， cell apoptosis rate of spinal neuron was decreased and the expressions of TNF-α and IL-8 were decreased in group DL （P < 0.05）. Conclusion Dexmedetomidine can reduce the Lidocaine-induced spinal cord never injury in rats by anti-apoptosis of neurons， and the mechanism is related to inhibition on inflammation.

[Key words] Dexmedetomidine； Lidocaine； Never injury； Apoptosis； Inflammation factor

椎管內麻醉為臨床常用的麻醉方法，但局麻藥的神經毒性可引起多種相關并發癥，影響患者預后，其機制與炎性細胞因子引起神經元凋亡有關[1-2]。右美托咪定為高選擇性α2腎上腺素能受體激動藥，可降低交感神經張力，從而間接提高了迷走神經張力，具有器官保護作用[3]。有研究已證實，右美托咪定激活副交感神經抗炎通路，抑制炎性反應，對休克和腦缺血再灌注損傷大鼠產生保護作用[4-5]。然而，右美托咪定是否能減輕局麻藥引起的脊髓神經毒性尚不清楚。因此，本研究旨在評價右美托咪定對利多卡因致大鼠脊髓神經損傷的影響，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性SD大鼠24只，體重250～280 g，由廣州醫科大學醫學動物實驗中心提供（動物合格證號SCXK2013-0024）。實驗流程遵循廣州醫科大學有關實驗動物保護和使用的指南，并經本單位實驗動物倫理委員會批準。于室溫24℃，濕度55%～65%的環境中飼養，自由攝食和飲水。采用隨機數字表法，將其分為三組（n=8）：對照組（C組）、利多卡因組（L組）、右美托咪定+利多卡因組（DL組）。

1.2 試劑及儀器

二甲基亞砜（Sigma公司，美國），右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥有限公司，批號：H20090248），PE-10導管（Smiths Medical公司，英國），BME-410A熱痛刺激儀（中國醫學科學院生物工程研究所），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-8（IL-8）克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），山羊抗兔IgG抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.3 模型建立

按參考文獻[6]進行鞘內置管。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，俯臥位，在枕骨大孔上方縱向切長約2 cm的切口，鈍性分離皮下組織和頸部肌肉，暴露寰枕膜，用針尖挑破寰枕膜可見清澈腦脊液涌出并隨呼吸波動，將已經消毒、一端封閉的充滿生理鹽水的PE-10導管向尾端插入7 cm，以鼠尾突然出現側擺或后腿抽動為導管成功到達椎管內的標志。至脊髓腰骶段，然后固定導管，并逐層縫合切口。術畢第1天鞘內注射1%利多卡因20 μL，30 s之內出現雙下肢癱瘓者為利多卡因篩選實驗陽性，如鉗夾雙上肢，躲避反應存在，而雙下肢無反應，夾尾反射消失，則選入實驗。術畢出現四肢癱瘓、活動障礙及利多卡因實驗陰性或出現單側肢體癱瘓者排除。

給藥方法

1.4 給藥方案

C組僅行鞘內置管后1 d注射二甲基亞砜20 μL對照；L組鞘內置管后1 d注射10%利多卡因（將5 g利多卡因標準品溶于50 mL二甲基亞砜中）20 μL；DL組在鞘內置管1 d后注射10%利多卡因，注射利多卡因前1 h腹腔注射右美托咪定15 μg/kg。

1.5 痛閾測定

參考文獻[7]采用熱輻射法分別于術前1 d（基礎值）及術后1、2、3 d時測定熱縮足潛伏期（TWL）。將一個有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，大鼠放在玻璃板上安靜后，采用BME-410A熱痛刺激儀照射大鼠足底前外側1/3處，照射開始至大鼠出現抬腿回避的時間為TWL，最長照射時間為30 s，以防止組織損傷，測定5次，每次間隔5 min，取測定結果的平均值。

1.6 TUNEL染色

于術后3 d行為學測試結束后，在各組大鼠隨機抽取4只，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉下，開胸，經心臟灌流生理鹽水100 mL及4%多聚甲醛100 mL，分離并取L4～6段脊髓組織，于Bonin′s液中固定24 h，組織塊經常規脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，延垂直脊髓長軸方向連續切片，片厚5 μm，制備切片分別用于TUNEL染色[8]。切片常規二甲苯脫臘梯度酒精脫水后蒸餾水沖洗。3%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水沖洗3 min×3次。標本片加TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化15 min，TBS洗1 min×3次[9-10]。標本片加標記緩沖液（Labeling，Buffer），20 μL/片，以保持切片濕潤，并置樣品于濕盒中，37℃標記2 h，TBS洗3 min×3次。用1%的TBS稀釋SABC，均勻后50 μL/片加至切片，37℃反應60 min，TBS洗5 min×4次[11]。DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗5 min。蘇木素復染1 min。TBS洗，蒸餾水洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。應用Image-pro Plus 6.0醫學圖像分析系統分析處理，取各大鼠脊髓斷面水平的連續切片，各組每個時間點每只大鼠選取三張切片，每張切片在損傷區隨機采集5個400倍視野[12]。400倍視野下計算凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.7 Western bolt分析

將其余4只大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉下斷頭取脊髓，分離L4～6段脊髓組織采用Western bolt，使用細胞裂解液提取蛋白，用Bradfor法進行蛋白定量，采用蛋白定量測定試劑盒（上海美季生物技術有限公司）[13-14]。取蛋白在SDS-聚丙酰胺凝膠上電泳，后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶37℃封閉1 h，加入兔抗大鼠TNF-α和IL-8克隆抗體（1∶5000），4℃孵育過夜；加入堿性磷酸酯酶標記山羊抗兔IgG抗體（1∶1000），常溫孵育2 h，曝光成像[15]。用Scion Image軟件檢測磷TNF-α和IL-8目的條帶和內參β-actin的灰度值，其比值作為TNF-α和IL-8蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時點TWL比較

三組大鼠TWL基礎值比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；C組大鼠各時點TWL比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；與C組比較，L組大鼠術后1、2、3 d時TWL均延長（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠術后2、3 d時TWL均縮短（P < 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時點TWL比較（s，x±s）

注：與C組比較，*P < 0.05；與L組比較，#P < 0.05；TWL：熱縮足潛伏期；C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組

2.2 各組大鼠脊髓神經元細胞凋亡率比較

與C組比較，L組大鼠脊髓神經元細胞凋亡率升高（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓神經元細胞凋亡率降低（P < 0.05）。見表2、圖1。

表2 各組大鼠脊髓神經元細胞凋亡率比較（%，x±s）

注：與C組比較，#P < 0.05；與L組比較，*P < 0.05；C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組

C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組

圖1 各組大鼠脊髓神經元細胞凋亡情況（TUNEL染色，400×）

2.3 各組大鼠脊髓炎癥因子表達比較

與C組比較，L組大鼠脊髓內TNF-α和IL-8的表達增強（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓內TNF-α和IL-8的表達減弱（P < 0.05）。見表3、圖2。

表3 各組大鼠脊髓炎癥因子表達比較（x±s）

注：與C組比較，#P < 0.05；與L組比較，*P < 0.05；C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-8：白細胞介素-8

C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-8：白細胞介素-8

圖2 各組大鼠脊髓炎癥因子表達情況

3 討論

本研究采用鞘內置管注射10%利多卡因的方法制備大鼠脊髓神經毒性模型，結果表明，鞘內注射利多卡因后大鼠TWL升高，腰段脊髓神經細胞凋亡增多，與相關文獻[7]結果一致，提示利多卡因誘發大鼠脊髓神經毒性的模型制備成功。

高濃度局麻藥所致的神經損傷是多個環節調控導致細胞凋亡而形成的最終結果，利多卡因可破壞神經纖維膜的磷脂和蛋白結構，產生不可逆性膜破裂，同時也抑制細胞氧化磷酸化過程，影響線粒體跨膜動作電位，從線粒體途徑促進神經元凋亡[16]，同時也有研究證實，局部注射高濃度利多卡因可激活神經組織內膠質細胞，進而發生神經炎性反應[17]。本研究證實，10%利多卡因鞘內注射后將引起脊髓神經元的細胞凋亡，也在腰段脊髓內檢測出高于正常水平的炎癥因子如TNF-α和IL-8。

右美托咪定作為α2腎上腺素能受體激動劑，其抗炎作用機制為直接抑制單核細胞、巨噬細胞合成炎性因子，并激活膽堿能抗炎通路[18]。IL-8由單核-巨噬細胞產生，其功能是激活中性粒細胞導致機體局部的炎性反應，達到殺菌和細胞損傷的目的[19]。TNF-α是最重要的炎癥介質，調節組織代謝活性并促使其他炎癥因子的合成和釋放[20]。本研究證實，脊髓神經損傷時，右美托咪定可有效抑制TNF-α和IL-8過表達，從而實現對抗神經凋亡的作用，提示IL-8可能是右美托咪定產生抗炎作用時細胞因子層面的作用靶點。

綜上所述，右美托咪定通過抗神經元細胞凋亡減輕利多卡因所致的大鼠脊髓神經損傷，其機制與抑制炎性反應的發生有關。

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（收稿日期：2016-12-23 本文編輯：李亞聰）