CGRP對UUO小鼠腎組織間質纖維化與炎性因子表達的干預作用

劉麗輝 石亮 王巖 谷昆峰 崔素婭 宋鐵鷹

·論著·

CGRP對UUO小鼠腎組織間質纖維化與炎性因子表達的干預作用

劉麗輝 石亮 王巖 谷昆峰 崔素婭 宋鐵鷹

目的 探討CGRP對小鼠單側輸尿管梗阻(UUO)模型腎間質纖維化的影響。方法 選擇雄性小鼠36只，建立小鼠UUO模型，前2 d治療組和模型組分別每天給予CGRP 1.0 nmol·kg-1·d-1和同等量0.9%氯化鈉溶液靜脈注射。觀察模型第14天腎小管損害百分比、腎間質纖維化程度、腎間質α-SMA平滑肌肌動蛋白、腎間質巨噬細胞數，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)以及F4/80 mRNA的表達。結果 CGRP顯著減輕腎小管損害和腎間質纖維化(P<0.05)；治療組腎間質巨噬細胞數F4/80和腎間質α-SMA表達顯著低于模型組 (P<0.05)；CGRP顯著抑制MCP-1以及F4/80mRNA的表達(P<0.05)。結論CGRP減少小鼠UUO模型腎間質巨噬細胞浸潤、降低MCP-1以及F4/80mRNA表達、抑制α-SMA的表達，從而減輕腎間質纖維化。

CGRP；單側輸尿管梗阻模型；腎間質纖維化；巨噬細胞

進展性腎損害的重要病理特征是腎間質組織炎性改變及纖維化改變，腎小球濾過率與腎小管間質病損程度呈負相關，且對預后的判斷比腎小球病變更有價值。因此，有效地抑制腎間質炎癥和纖維化可減緩腎臟疾病的進展[1,2]。降鈣素基因相關肽 (CGRP) 是一種迄今公認的最強的內源性舒血管多肽[3]，通過提高腎小球毛細血管超濾系數，抑制腎血管細胞收縮和改善對腎臟微循環，從而起到對保護腎臟的作用[4]，但未見相關文獻報道其對腎間質組織細胞纖維化和炎癥因子表達的影響。本實驗擬通過小鼠單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型來研究CGRP對腎間質纖維化和炎性因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 清潔級昆明小鼠(河北醫科大學動物實驗室提供，合格證號：SJL-F8-2015-5-9)36只，雄性，6～8周齡，體重(20±2)g。

1.2 試劑 CGRP(Catalog公司)，大鼠抗小鼠F4/80多克隆抗體(Abcam公司)，小鼠抗人α-SMA單克隆抗體(Dako公司),小鼠HRP二抗。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和UUO造模方法： 將實驗小鼠隨機分成假手術組、模型組和CGRP治療組，每組12只。模型組和CGRP治療組小鼠以乙醚麻醉后，行左側輸尿管結扎術，而假手術組僅游離左側輸尿管,不結扎[5]。

1.3.2 給藥方法：CGRP治療組靜脈注射 CGRP 1.0 nmol·kg-1·d-1，而假手術組、模型組給予同等量0.9%氯化鈉溶液靜脈注射。

1.3.3 標本收集：在UUO術后14 d處死3組小鼠后取術側腎組織。一半置應用4%多聚甲醛固定后用作病理切片檢查和免疫組化實驗；另一半置于液氮中冷凍保存，以備提取總RNA，用于熒光實時定量 PCR(RT-PCR)檢測。

1.3.4 腎組織 HE染色病理形態學觀察：將4%多聚甲醛固定液固定的腎組織常規石蠟包埋切片，經HE染色后，光鏡下觀察腎小管間質的病理改變。對腎小管損害程度采用百分比評分法進行評估，計算20個以上高倍視野(×400)腎皮質中發生損害(腎小管擴張、萎縮、管型、壞死或小管炎)的腎小管數目和總腎小管數，以損害的腎小管數占總腎小管數的百分比表示。

1.3.5 腎組織Masson染色病理觀察：取腎組織用4%多聚甲醛固定后常規石蠟包埋切片，經Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質的病理改變；采用北京航天大學醫學圖像采集及分析系統，光鏡(×200)下采集 Masson 染色腎臟病理圖像，藍色為纖維化陽性染色區。每張切片隨機采集5個不重疊視野，測量每個視野中腎小管間質纖維化陽性染色的相對面積，取平均值。腎小管間質纖維化相對面積=腎小管間質纖維化陽性(藍色)面積/整個視野面積。

2 結果

2.1HE染色 光鏡下觀察可見：模型組小鼠腎小管發生程度不一的膨脹,部分小管和間質的組織結構消失。腎小管上皮組織細胞水腫、空泡樣變性，部分凋亡脫落；模型組腎間質細胞面積占總面積的比值與假手術組相比顯著增加 (P<0.01)。而CGRP治療組可顯著改善上述病理變化(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 3組腎小管間質損害、腎間質纖維化和巨噬細胞積聚 ±s

注：與假手術組比較，*P<0.05,#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,☆P<0.01

2.2Masson染色 結果顯示：模型組小鼠腎小管間質纖維化與假手術組相比顯著增高(P<0.01)，而CGRP治療組腎小管間質纖維化相對面積顯著減少(P<0.05)(見表1和圖1B)。免疫組化顯示，在假手術組小鼠除血管外的腎小管間質組織和腎小球組織中，幾乎無α-SMA蛋白的表達；模型組小鼠腎組織中的α-SMA陽性染色主要積聚于腎小管間質，而腎小球內則不明顯(P<0.01)。且模型組小鼠腎小管間質中α-SMA陽性染色明顯高于CGRP治療組(P<0.05)。見表1,圖2。

2.3UUO模型建立14d后，腎間質有大量巨噬細胞浸潤，在腎小管間質病損處可見浸潤巨噬細胞明顯積聚，而假手術組僅偶見少數巨噬細胞(P<0.01)。CGRP治療組腎間質巨噬細胞浸潤顯著受抑制，巨噬細胞數明顯低于模型組(P<0.05)。見表1，圖2。

2.4F4/80、MCP-1mRNA在假手術組的小鼠腎組織幾乎無的表達，而在模型組小鼠明顯上調(P<0.05或<0.01；而經過CGRP治療后MCP- 1mRNA的表達較模型組顯著下調(P<0.05或<0.01)。見圖3、4。

圖1 UUO模型；A，HE染色；B,Masson染色；從左到右分別為假手術組，治療組以及模型組

圖2UUO模型；A，α-SMA免疫組化染色；B,F4/80免疫熒光染色法；紅色代表F4/80巨噬細胞，藍色代表DAPI核染色；從左到右分別為假手術組，治療組以及模型組

3 討論

各類炎癥性腎臟疾病進展為終末期腎衰竭的最后共同過程是腎小管間質組織細胞的損害,主要征象為腎小管損害和巨噬細胞對間質組織的浸潤,并最終發展為腎間質纖維化。腎間質纖維化(RIF)是涉及多種生物活性物質參與、腎固有及間質細胞參與、細胞外基質生成/降解失調等多因素的病理過程，近期研究實驗證明,在早期腎小管上皮細胞在受損或受激惹后,多種黏附、趨化及生長因子等被激活表達,通過對多核白細胞、巨噬細胞和T細胞等積聚，對腎間質細胞造成直接或間接的損害,同時細胞因子之間的協同作用可以讓更多的炎性反應過程發動，最終導致腎間質細胞纖維化，這其中巨噬細胞發揮了顯著作用。巨噬細胞雖然歸屬于免疫細胞，但其活化后分泌多種具有生物活性物質參與調控這一過程。根據細胞功能的不同可將巨噬細胞分為兩種，即分泌腫瘤壞死因子α、白介素-1β、γ-干擾素等促炎型細胞因子的M1型巨噬細胞；分泌IL-10、IL-13、TGF-β、血管內皮細胞生長因子、結締組織生長因子、血小板源性生長因子等抑炎及促修復的M2型巨噬細胞。根據M2功能不同，進一步又分為M2a、M2reg兩種，M2a起著促進組織修復功能同時造成組織纖維化，M2reg則起著抑制組織炎癥功能。研究表明在RIF疾病早期，以M1為主，隨病程延長M2漸增多。Fujiu等[6]對單側輸尿管結扎模型小鼠研究發現，腎間質中M1數量與RIF程度正相關。特殊的腎間質微環境介導巨噬細胞表型轉化及巨噬細胞分泌多種生物學活性物質誘導腎固有細胞損傷、EMT、ECM生成/降解失調，對其中任何一個環節的干預可能為延緩RIF進展治療靶點，采用不同手段抑制巨噬細胞浸潤可減輕腎損害和纖維化[1,7]。

圖3 UUO模型各組F4/80表達比較

圖4 UUO模型各組MCP-1 mRNA表達比較

CGRP是一種生物活性肽，由37個氨基酸組成，組織中鈣離子的存在，是CGRP的釋放的依賴因素，當各種生化或理化因素刺激神經末梢時，位于神經末梢和細胞膜表面的“辣椒素受體”被激活，引起細胞外鈣離子流入細胞膜內，鈣離子在細胞內的濃度因此提升,進而誘導釋放CGRP。CGRP在人體內主要以一種神經遞質的形式存在，并在心血管系統和神經系統中主要分布。在血管系統中,在所有血管的神經纖維中幾乎都可發現CGRP存在，主要在動脈及靜脈的主干、分支血管壁外膜分布表達，在血管壁外膜與平滑肌層之間CGRP神經纖維相互交織并包纏血管全程。此外，在泌尿生殖道組織、呼吸道組織以及消化道組織中，可見大量CGRP存在。在人體內，還有多種細胞具備合成降鈣素基因相關肽的功能，例如：嗜酸性粒細胞、內皮細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞、朗格漢細胞以及淋巴細胞等。CGRP僅僅在與CGRP受體相結合后，相應的生理學作用才能表達出來，其中多種調節蛋白的調節控制作用一直存在于這結合過程之中。截至目前為止，大量研究發現，在人體血管系統、呼吸道、胃腸組織、腎臟組織及骨骼肌等系統組織中，有大量CGRP受體表達存在。研究證明，CGRP受體亦存在于人及鼠的肺泡巨噬細胞和外周巨噬細胞的胞膜上，CGRP與CGRP受體結合后，小鼠巨噬細胞被激活后產生腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-12亦被抑制，并雙相調節IL-6的生成[8]。早期的研究表明，降鈣素基因相關肽可以抑制巨噬細胞等炎性細胞的浸潤，降低炎癥性介質的表達[9]，還可以抑制肝纖維化進展[10]。CGRP作為目前已知的擴血管作用最強的內源性擴血管物質，其擴張血管的效果比異丙腎上腺素大10～100倍，比5-羥色胺、ATP、乙酰膽堿和P物質至少高1 000倍。在機體不同臟器組織中，血液能不斷重新分配流動，就依賴于CGRP強大的擴血管作用。動脈粥樣硬化病變進展過程中，CGRP在病變早期對動脈粥樣硬化的發生發展起到抑制作用，甚至逆轉作用，均依賴于CGRP對血管平滑肌的增殖的抑制作用,以及對血管內皮細胞的損傷的修復作用[11]。另有研究檢測表明，在同種異體器官移植術后，移植器官血管組織中CGRP表達水平增高，對炎癥細胞、炎癥因子的浸潤起到明顯抑制作用，減輕移植后血管細胞損害，抑制細胞凋亡，從而保護移植器官存活[12]。對缺血一再灌注造成的腎小球毛細血管內皮和腎小管上皮的損傷的修復和保護作用，提示CGRP可以作為治療ARF的有益藥物。

本研究采用經典的單側輸尿管結扎(UUO) 致小鼠腎間質纖維化模型。通過光鏡下觀察發現腎小管組織發生不同程度的膨脹，部分小管和間質的組織結構消失。腎小管上皮組織細胞水腫、空泡樣變性，部分凋亡脫落；而CGRP治療組可在一定程度上改善上述病理變化，CGRP的治療可以顯著減輕腎損害。肌成纖維細胞在在纖維化過程中發揮關鍵作用，其標記蛋白是α-SMA。在人體腎臟組織中發現腎小管間質內α-SMA表達量與間質纖維化程度及腎功能惡化程度呈正相關[13]，而在UUO鼠模型中也發現術后3dα-SMA表達明顯增多[14]。因此，α-SMA可作為評價腎間質細胞組織纖維化分級程度的重要指標之一。腎間質表達α-SMA是腎間質纖維化的重要指標[15]。通過Masson染色和α-SMA免疫組化染色，我們發現CGRP能夠明顯抑制腎間質纖維化形成和α-SMA表達，這表明CGRP可能通過抑制腎間質肌成纖維細胞聚集和細胞外基質合成來抑制腎間質組織纖維化。UUO模型建立14d后，腎間質有大量巨噬細胞浸潤；在腎小管間質損害處，主要有浸潤巨噬細胞積聚，F4/80是巨噬細胞的表面標志，巨噬細胞浸潤與腎臟固有細胞表達MCP-1增加有密切關系，通過F4/80的免疫熒光染色，我們發現，CGRP抑制腎臟巨噬細胞F4/80浸潤，同時還可以顯著下調腎組織F4/80和MCP-1的mRNA表達。CGRP治療組顯著抑制腎間質巨噬細胞浸潤。

本研究首次通過小鼠UUO模型證明CGRP能減少腎組織中F4/80和MCP-1mRNA的表達、抑制腎間質巨噬細胞浸潤，減輕腎間質纖維化，提示CGRP在腎間質纖維化的治療中有著不可忽視的應用前景。

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Intervention effects of CGRP on renal interstitial fibrosis and expression of inflammatory cytokines in mice with unilateral ureteral obstruction

LIULihui*,SHILiang,WANGYan,etal.

*DepartmentofUrinarySurgery,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on renal interstitial fibrosis and expression of Inflammatory cytokines in mice with unilateral ureteral obstruction (UUO).Methods The animal models with UUO were established in 36 mice.The mice in treatment group were given CGRP 1.0nmol·kg-1·d-1by intravenous injection,however,the mice in model group were given equivalent 0.9% sodium chloride solution by intravenous injection. The mice in both groups were sacrificed after 14-day administration,then the percentage of renal tubular lesion,the extent of renal interstitial fibrosis, number of renal interstitial macrophage cells, the expression levels of renal interstitial expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and F4/80 mRNA were observed and compared between two groups.Results CGRP alleviated significantly renal tubular lesion and renal interstitial fibrosis (P<0.05).The expression levels of α-SMA and macrophages number in renal interstitial in treatment groups were significantly lower than those in model group (P<0.05).MoreoverCGRPinhibitedsignificantlytheexpressionlevelsofMCP-1andF4/80mRNA(P<0.05). Conclusion CGRP can reduce macrophage infiltration of mice with UUO,decrease the expression levels of MCP-1 and F4/80 mRNA,inhibit the expression of α-SMA so as to relieve renal interstitial fibrosis.

calcitonin gene-related peptide；unilateral ureteral obstruction model; renal interstitial fibrosis; macrophages

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.016

050011 河北省石家莊市第一醫院泌尿外科(劉麗輝),影像科(石亮),普外科(王巖),麻醉科(谷昆峰、崔素婭、宋鐵鷹)

R

A

1002-7386(2017)04-0540-05

2016-10-15)