TRPV1及其致敏因子在子宮內膜異位癥患者血清、在位內膜、異位內膜中的表達變化

付一元 肖青 范雪梅 傅靜 王蔚軍

·論著·

TRPV1及其致敏因子在子宮內膜異位癥患者血清、在位內膜、異位內膜中的表達變化

付一元 肖青 范雪梅 傅靜 王蔚軍

目的 本研究旨在探討TRPV1及其致敏因子在子宮內膜異位癥患者的血清、在位內膜、異位內膜的表達變化規律，以期對子宮內膜異位癥部分發病機制進行研究。方法 隨機選擇2013年10月至2015年10月行手術治療的子宮內膜異位癥患者70例作為研究對象，其中痛經組45例，無痛組25例。另外選擇同時期手術的子宮肌瘤患者30例，作為對照組。依據視覺模擬評分法將痛經組45例患者分組，包括輕度、中度和重度痛經患者各15例。在手術前空腹取靜脈血，測定下列指標血清神經生長因子(NGF)、緩激肽(BK)和前列腺素F2α(PGF2α)，手術中采集在位內膜及異位內膜標本，分別采用免疫組化法和免疫印記檢測法檢測在位內膜組織和異位內膜組織中NGF、 BKB1R、TRPV1表達水平。結果 子宮內膜異位癥痛經組患者血清中NGF、BK和PGF2α的含量顯著高于對照組和無痛組(P<0.05)；血清中NGF表達與PGF2α以及BK表達與PGF2α表達均呈正相關(P<0.05)。而痛經患者按照VAS分級從輕度、中度和重度上升，患者血清中NGF、BK和PGF2α的含量亦呈逐漸升高趨勢(P<0.05)，Pearson相關分析也表明血清中NGF、BK和PGF2α表達均與VAS呈正相關(P<0.05)。通過免疫組化和免疫印記方法檢測對在位內膜和異位內膜進行研究發現NGF、BKB1R、TRPV1主要定位于細胞漿，在位、異位內膜的腺體內均有表達。痛經組患者在位內膜NGF、BKB1R、TRPV1的表達顯著高于無痛組和對照組(P<0.05)；而痛經組患者異位內膜NGF、BKB1R、TRPV1的表達顯著高于無痛組(P<0.05)。相關性亦表明NGF與TRPVl，BKB1R與TRPV1表達呈正相關(P<0.05)。結論TRPV1及其致敏因子NGF、BKB1R、PGF2α可能在子宮內膜異位癥患者痛經的發生機制中發揮重要作用。

子宮內膜異位癥；痛經；瞬時感受器電位香草酸受體1；神經生長因子；緩激肽

子宮內膜異位癥(endometriosis)指因某種因素使子宮內膜在子宮腔以外身體的其他部位生長[1]。這種異位的內膜在組織學上不但有內膜的腺體，且有內膜間質圍繞，其發病率大約占全部育齡期女性的10%～15%[2]。臨床表現各異，其中盆腔疼痛癥狀最為典型，統計顯示子宮內膜異位癥患者87.7%有痛經[3]。有研究表明，子宮內膜異位癥病灶部位能夠產生炎癥，所釋放的炎性介質通過啟動相關信號轉導途徑，激活疼痛相關離子通道，最終引發疼痛。研究表明瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential rallilloid receptor 1，TRPV1)及其致敏因子參與了內膜異位癥痛覺傳遞過程[4]。本研究旨在探討TRPV1及其致敏因子在子宮內膜異位癥患者的血清、在位內膜、異位內膜的表達變化規律。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選擇2013年10月至2015年10月廣州市婦女兒童醫療中心行手術治療的子宮內膜異位癥患者70例作為研究對象，年齡28～48歲，平均年齡(35.3±9.7)歲。其中25例無盆腔疼痛，年齡28～48歲，平均年齡(36.4±9.4)歲；45例患者伴有痛經，年齡28～48歲，平均年齡(34.2±8.9)歲。依據視覺模擬評分法(visual analogue scale，VAS)將痛經組45例患者分組，包括輕度、中度和重度痛經患者各15例。在手術開始前上午8∶00時空腹經肘靜脈抽取外周靜脈血，采用酶聯免疫法測定下列指標血清神經生長因子(NGF)、緩激肽(BK)和前列腺素F2α(PGF2α)，手術中采集在位內膜及異位內膜標本，術后70例患者均經病理檢測證實為子宮內膜及異位內膜組織。另外選擇同時期在院手術的子宮肌瘤患者30例，術中采集子宮內膜組織作為對照組，要求既往無痛經病史，對照組28～48歲，平均年齡(36.3±9.2)歲，分別采用免疫組化法和免疫印記檢測法檢測在位內膜組織和異位內膜組織中NGF、 BKB1R、TRPV1表達水平。本研究經過醫院倫理委員會討論通過，術前全部進行知情同意書告知并簽字確認。

1.2 納入標準 (1)年齡介于25～50歲，未絕經的育齡女性；(2)手術前3個月之內未接受任何激素及中西藥物治療；(3)手術后病理確診為子宮內膜異位癥。

1.3 排除標準 (1)合并盆腔炎癥、盆腔良惡性腫瘤、囊腫、子宮肌瘤等婦科疾病；(2)合并心腦血管疾病、肝腎疾病、造血系統疾病等疾病；(3)近三個月內服用中西藥治療或者應用任何激素者；(4)無自知力患者(精神疾病)。

2 結果

2.1 3組患者血清中NGF、BK、PGF2α的含量表達及相關性分析 子宮內膜異位癥痛經組患者血清中NGF的含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者血清中NGF的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者血清NGF含量與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，痛經組患者血清中BK的水平升高較為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者血清BK水平盡管略高于無痛組，但差異無統計學意義(P>0.05)；無痛組患者血清BK水平與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。痛經組患者血清中PGF2α的含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者血清中PGF2α的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者血清PGF2α含量亦高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關分析表明：血清中NGF表達與PGF2α表達呈正相關(r=0.468，P=0.004)；血清中BK表達與PGF2α表達亦呈正相關(r=0.513，P=0.000)；血清中NGF表達與BK表達之間無相關性(r=0.185，P=0.278)。見表1、2。

組別NGFBKPGF2α對照組(n=30)0．63±0．28?4．68±1．37?6．33±2．12?無痛組(n=25)0．71±0．32?4．94±1．6911．03±3．68?痛經組(n=45)1．62±0．876．02±1．8516．75±6．88

注：與痛經組比較,*P<0.05；與無痛組比較,#P<0.05

表2 血清NGF、BK、PGF2α之間的相關性分析

2.2 不同VAS分級患者血清中NGF、BK、PGF2α的表達及相關性分析 本研究中子宮內膜異位癥痛經組患者45例患者按照VAS分級：輕度、中度和重度者均為15例。中度痛經患者血清中NGF的含量顯著高于輕度痛經患者，差異有統計學意義(P<0.05)；重度痛經患者血清中NGF的含量顯著高于中度和輕度痛經患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。中度痛經患者血清中BK的含量顯著高于輕度痛經患者，差異有統計學意義(P<0.05)；重度痛經患者血清中BK的含量顯著高于中度和輕度痛經患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。中度痛經患者血清中PGF2α的含量顯著高于輕度痛經患者，差異有統計學意義(P<0.05)；重度痛經患者血清中PGF2α的含量顯著高于中度和輕度痛經患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關分析表明：血清中NGF表達與VAS呈正相關(r=0.635，P=0.000)；血清中PGF2α表達與VAS呈正相關(r=0.768，P=0.000)；血清中BK表達與VAS之間呈正相關(r=0.447，P=0.002)。見表3、4。

組別NGFBKPGF2α輕度1．04±0．18?#4．76±0．69?#8．76±3．69?#中度1．71±0．36?5．82±1．13?16．64±5．65?重度2．11±0．657．48±1．6124．85±6．36

注：與重度痛經組比較,*P<0.05；與中度比較,#P<0.05

表4 血清NGF、BK、PGF2α與VAS之間的相關性分析

2.3 在位、異位內膜中NGF、BKB1R、TRPV1蛋白表達的免疫組化檢測

2.3.1NGF、BKB1R、TRPV1主要定位于細胞漿，在位、異位內膜的腺體內均有表達。子宮內膜異位癥痛經組患者在位內膜NGF的含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者在位內膜NGF的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者在位內膜NGF含量與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，痛經組患者在位內膜BKB1R的水平升高較為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者在位內膜BKB1R水平盡管略高于無痛組，但差異無統計學意義(P>0.05)；無痛組患者在位內膜BKB1R水平與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。痛經組患者在位內膜TRPV1的含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者在位內膜TRPV1的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者在位內膜TRPV1含量亦高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 在位內膜中NGF、 BKB1R、TRPV1蛋白表達的免疫組化檢測比較 ±s

注：與痛經組比較,*P<0.05；與無痛組比較,#P<0.05

2.3.2 痛經組患者異位內膜NGF的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者異位內膜NGF含量與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。痛經組患者異位內膜BKB1R水平高于無痛組，但差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者異位內膜BKB1R水平與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。痛經組患者異位內膜TRPV1的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者在位內膜TRPV1含量盡管略高于對照組，差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 異位內膜中NGF、 BKB1R、TRPV1蛋白表達的

注：與痛經組比較,*P<0.05

2.4 在位、異位內膜中NGF、BKB1R、TRPV1蛋白表達的免疫印跡試驗NGF、BKB1R、TRPV1主要定位于細胞漿，在位、異位內膜的腺體內均有表達。子宮內膜異位癥痛經組患者在位內膜NGF的含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者在位及異位內膜NGF的含量顯著高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者在位內膜NGF含量與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，痛經組患者在位內膜BKB1R的水平升高較為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者在位及異位內膜BKB1R水平均高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者在位內膜BKB1R水平與對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。痛經組患者在位內膜TRPV1的含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；痛經組患者在位及異位內膜TRPV1水平均高于無痛組，差異有統計學意義(P<0.05)；無痛組患者在位內膜TRPV1含量盡管略高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表7、8。

表7 在位內膜中NGF、 BKB1R、TRPV1蛋白表達的免疫印跡試驗比較 ±s

注：與痛經組比較,*P<0.05

表8 異位內膜中NGF、 BKB1R、TRPV1蛋白表達的免疫印跡試驗比較 ±s

注：與痛經組比較,*P<0.05

2.5 在位內膜、異位內膜NGF、BKB1R與TRPV1之間的相關性分析 在位內膜中NGF與BKB1R的蛋白表達呈正相關(r=0.869，P<0.05)；BKB1R與TRPV1的表達呈正相關(r=0.871，P<0.05)；NGF與TRPV1的表達呈正相關(r=0.762，P<0.05)。異位內膜中NGF與BKB1R的蛋白表達呈正相關(r=0.951，P<0.05)；BKB1R與TRPV1的表達呈正相關(r=0.974，P<0.05)；NGF與TRPV1的表達呈正相關(r=0.962，P<0.05)。見表9。

表9 在位內膜、異位內膜NGF、BKB1R與TRPV1之間的相關性分析

3 討論

子宮內膜異位癥是指有活性的子宮內膜腺體細胞和間質細胞種植在子宮內膜以外的位置而形成的一種育齡期女性常見的激素依賴性、慢性炎癥性婦科疾病[5]。內膜異位癥表現出類似于惡性腫瘤所具備的種植、浸潤及遠隔部位轉移的特性，病變分布較為廣泛，形態各異，臨床主要表現為盆腔疼痛、不孕癥、月經紊亂、盆腔包塊等。盆腔疼痛形式多樣，以進行性加重的痛經最為常見，疼痛位置較深，不能準確定位，疼痛周期性發作，可伴發腹壁肌緊張，疼痛嚴重患者可出現煩躁、易怒、焦慮、抑郁、睡眠障礙等。近年來該病發病率呈逐年上升趨勢，發病機制尚未明確，目前多數觀點認為由于異位內膜局部前列腺素水平升高、炎性因子集聚以及異位內膜中神經出現異常生長致使中樞神經系統與周圍神經敏感性增強而引發，此外局部病灶增大而導致的機械性壓迫和牽拉也是造成疼痛的重要因素[6,7]。因此，深入研究子宮內膜異位癥患者疼痛發生機制具有十分重要的意義。

疼痛是各種傷害性刺激作用在機體時造成的組織潛在或實質性損傷而引發的一種令人不愉快的感覺和情緒上的主觀感受，盆腔疼痛是子宮內膜異位癥最典型癥狀[8]。痛覺感受器位于脊神經背根脊神經節以及三叉神經節內初級感覺神經元的神經末梢之中，廣泛分布在肌肉組織、皮膚、關節以及內臟器官[9]。痛覺感受器可以被炎癥介質所增敏，當機體發生炎癥時，機體釋放的炎癥介質能夠激活位于痛覺感受器末端的離子通道，形成動作電位，從而引發疼痛。

TRPV1是感知疼痛的關鍵分子之一[10]，研究證實TRPV1存在于傷害性感受器上的一類非選擇性陽離子通道蛋白，屬于瞬間感受器，TRPV1的致敏因素除辣椒素外，還包括傷害性刺激、炎性介質、熱刺激、組織損害刺激物、細胞外滲透壓改變以及靜電荷等因素[11]。TRPV1被激活后主要造成鈣離子等陽離子的內流，進而參予痛覺形成與整合的病理生理過程。因此TRPV1能夠作為連接外界環境與神經系統之間的橋梁，可以將損傷性刺激轉換成內向電流，有學者指出TRPV1在傷害性刺激的痛覺形成中處于核心地位[12]。

長期以來子宮內膜異位癥被認定為是一種炎癥性疾病，炎癥發生時，炎癥組織能夠釋放多種炎性介質，TRPV1可以在多種炎性介質的調節被致敏，包括神經生長因子、緩激肽和前列腺素等[13]。這些炎性介質在損害性感受器中通過激活多種蛋白激酶來發揮作用。而TRPV1則恰好是這些蛋白激酶在炎癥熱刺激致痛覺敏感過程中最重要的靶分子之一。同時，TRPV1對于熱刺激致痛覺敏感的閾值能夠隨內環境pH值的下降以及痛覺致敏因素(如神經生長因子、緩激肽、前列腺素和ATP等)的存在而降低，發生痛覺敏感，即在生理體溫狀態下即可被激活[14]。有研究表明在前列腺素的存在的條件下，TRPV1激活的溫度閾值甚至低至35℃[15]。這能夠解釋子宮內膜異位癥患者為何經常出現盆腔疼痛，這已有研究報道證實，但TRPV1激活與子宮內膜異位癥的臨床分期沒有關聯[15]。

本研究結果顯示，子宮內膜異位癥痛經組患者血清中NGF、BK和PGF2α的含量顯著高于對照組；痛經組患者血清中NGF、BK和PGF2α含量顯著高于無痛組；無痛組患者血清NGF、BK和PGF2α含量與對照組之間比較差別無統計學意義。相關分析表明：血清中NGF表達與PGF2α以及BK表達與PGF2α表達均呈正相關，而血清中NGF表達與BK表達之間無相關性。而癥痛經患者按照VAS分級從輕度、中度和重度上升，患者血清中NGF、BK和PGF2α的含量亦呈逐漸升高趨勢，Pearson相關分析也表明血清中NGF、BK和PGF2α表達均與VAS呈正相關。通過免疫組化和免疫印記方法檢測對在位內膜和異位內膜進行研究發現NGF、BKB1R、TRPV1主要定位于細胞漿，在位、異位內膜的腺體內均有表達。痛經組患者在位內膜NGF、BKB1R、TRPV1的表達顯著高于無痛組和對照組；而痛經組患者異位內膜NGF、BKB1R、TRPV1的表達顯著高于無痛組。相關性亦表明NGF與TRPVl，BKB1R與TRPV1表達呈正相關，即NGF、BKB1R的表達升高能夠促進TRPVl的表達上升，由此推測子宮內膜異位癥患者盆腔疼痛與TRPV1及其致敏因子激活TRPV1通道的存在關聯，子宮內膜出現異位種植播散后，在局部形成炎癥反應，在神經生長因子、緩激肽、前列腺素等炎癥介質的共同作用下，TRPV1陽離子通道激活開放，TRPV1表達水平上升，疼痛閾值下降導致痛覺過敏，最終導致盆腔疼痛的發生。

1 宋楠.子宮內膜異位癥疼痛與瞬時受體電位辣椒素亞型-1 表達的研究.中國協和醫科大學,2010.127.

2PohóczkyK,KunJ,SzalontaiB,etal.Estrogen-dependentup-regulationofTRPA1andTRPV1receptorproteinsintheratendometrium.Journalofmolecularendocrinology,2016,56:135-149.

3KobayashiH,YamadaY,MoriokaS,etal.Mechanismofpaingenerationforendometriosis-associatedpelvicpain.Archivesofgynecologyandobstetrics,2014,289:13-21.

4 王水英,黃荷鳳.子宮內膜異位癥不孕與盆腔內環境及表觀遺傳學的關系.中國實用婦科與產科雜志,2013,29:545-548.

5DeClercqK,HeldK,VanBreeR,etal.Functionalexpressionoftransientreceptorpotentialchannelsinhumanendometrialstromalcellsduringthelutealphaseofthemenstrualcycle.HumanReproduction,2015,41:268-273.

6TaylorRN,KaneMA,SidellN.Pathogenesisofendometriosis:rolesofretinoidsandinflammatorypathways//Seminarsinreproductivemedicine.ThiemeMedicalPublishers,2015,33:246-256.

7 李彥博,李新,譚爰麗,等.神經生長因子的分布情況與子宮內膜異位癥疼痛的相關性研究.實用臨床醫藥雜志,2015,19:45-47.

8TrioloO,LaganàAS,SturleseE.Chronicpelvicpaininendometriosis:anoverview.Journalofclinicalmedicineresearch,2013,5:153-163.

9 王文莉,張穎,郭銀樹,等.子宮內膜異位癥患者神經因子的表達及與痛經的關系.北京醫學,2016,38:193-196.

10SchweppeKW,RabeT,LanghardtM,etal.Endometriosis-Pathogenesis,Diagnosis,andTherapeuticOptionsforClinicalandAmbulatoryCare.JournalfürReproduktionsmedizinundEndokrinologie-JournalofReproductiveMedicineandEndocrinology,2013,10:102-119.

11TaylorRN,HummelshojL,StrattonP,etal.Painandendometriosis:Etiology,impact,andtherapeutics.MiddleEastFertilitySocietyjournal,2012,17:221-225.

12 于玲,田永杰.子宮內膜異位癥發病相關因素的臨床研究.山東大學學報 (醫學版),2013,51:79-83.

13 劉莉娜,姜盟,王廣蘭,等.子宮內膜異位癥在位內膜神經纖維分布與疼痛關系的研究.實用婦產科雜志,2012,28:654-657.

14 張海燕,朱芝玲.子宮內膜異位癥疼痛與緩激肽B1 受體阻斷劑的關系.國際婦產科學雜志,2012,39:503-506.

15 朱麗波,張信美.子宮內膜異位癥疼痛發病機制及目前治療問題探討.中國實用婦科與產科雜志,2013,29:11-14.

Changes of expressions of TRPV1 and its sensitizing factor in serum, eutopic endometrium and ectopic endometrium of patients with endometriosis

FUYiyuan,XIAOQing,FANXuemei,etal.

DepartmentofGynecology,MedicalCenterForWomenandChildren,Guangzhou510623,China

Objective To investigate the change regulation of expressions of TRPV1 and its sensitizing factor in serum, eutopic endometrium and ectopic endometrium of patients with endometriosis in order to explore the pathogenesis mechanism of endometriosis. Methods Seventy patients with endometriosis who were admitted and treated in our hospital from October 2013 to October 2015 were randomly divided into dysmenorrhea group (n=45)andnon-paingroup(n=25).Besidestheother30patientswithuterinefibroidswhounderwentsynchronizationsurgerywereservedascontrolgroup.Moreoverthe45patientsindysmenorrheagroupwereredividedinto3subgroupsbymeansofVisualAnalogueScale,includingmild,medium,severedysmenorrheagroups,with15patientsineachgroup.TheexpressionlevelsofofTRPV1andsensitizingfactorsincludingNGF,BKB1R,PGF2αinserum,eutopicendometriumandectopicendometriumofpatientswithendometriosisweredetectedbyELISA,immunohistochemistryandWesternBlot,respectively. Results The expression levels of NGF,BK and PGF2αin dysmenorrhea group were significantly higher than those in control group and non-pain group (P<0.05). The expression of NGF in serum was positively correlated to that of PGF2α,and the expression of BK was positively correlated to that of PGF2α(P<0.05).ThePearsoncorrelationanalysisshowedthatexpressionsofNGF,BK,PGF2αwerepositivelycorrelatedwithVAS(P<0.05).TheresultsbyimmunohistochemistryandWesternBlotshowedthattheexpressionlevelsofNGF,BKB1RandTRPV1indysmenorrheagroupweresignificantlyhigherthanthoseinnon-paingroupandcontrolgroup(P<0.05).ThecorrelationanalysisshowedthattheexpressionofNGFwaspositivelycorrelatedtothatofTRPVl,BKB1R,TRPV1(P<0.05).Conclusion TRPV1 and its sensitizing factor including NGF,BKB1R,PGF2α may play an important role in the pathogenesis mechanism of dysmenorrhea in patients with endometriosis.

endometriosis; dysmenorrhea; transient receptor potential vanilloid receptor 1; nerve growth factor; bradykinin

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.009

510623 廣東省廣州市婦女兒童醫療中心婦科

R

A

1002-7386(2017)04-0516-05

2016-09-18)