非小細(xì)胞肺癌PKM2的表達(dá)及與放療敏感性的關(guān)系分析

王偉星 楊波 余麗芳 趙杰 劉健 章必成 饒智國

·論著·

非小細(xì)胞肺癌PKM2的表達(dá)及與放療敏感性的關(guān)系分析

王偉星 楊波 余麗芳 趙杰 劉健 章必成 饒智國

目的 探討非小細(xì)胞肺癌患者PKM2的表達(dá)情況與放療敏感性的關(guān)系。方法 取門診就診的非小細(xì)胞肺癌患者68例為研究對象，所有患者病例均經(jīng)臨床和手術(shù)病理確診。對入組患者放射治療，根據(jù)放療敏感性分為A、B 2組：A組為對放療敏感患者，B組為對患者不敏感患者。取放療前手術(shù)切除的腫瘤組織，免疫組化技術(shù)法檢測PKM2蛋白的表達(dá)情況；RT-PCR法檢測PKM2的mRNA表達(dá)情況；Western blot 檢測PKM2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，PKM2蛋白在A組和B組的高表達(dá)率分別為21.62%(8/37)和58.06%(18/31)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與A組比較，B組PKM2mRNA的表達(dá)明顯上升(P<0.05)。Westernblot檢測結(jié)果顯示，與B組比較，A組PKM2蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)KM2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明PKM2 的表達(dá)可作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者放療敏感性的重要分子標(biāo)志，從而實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療。

PKM2；非小細(xì)胞肺癌；放療敏感性

肺是人體最主要的呼吸器官，統(tǒng)計(jì)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中已居于首位，并且其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，它已成為危害生命健康的一種主要疾病。從組織學(xué)上來說，肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。其中非小細(xì)胞肺癌占75%～90%[1]，其發(fā)病率遠(yuǎn)高于小細(xì)胞肺癌[2]。并且統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)它的五年無進(jìn)展生存率甚至不到15%[3]。肺癌的治療方法有很多，如手術(shù)、內(nèi)分泌、放療、化療等，對于非小細(xì)胞肺癌患者來說，放療仍然占主導(dǎo)地位。但不同的患者，就算病理特征、年齡等沒有差異，對放療的敏感性也存在相當(dāng)大的差異，這是影響放療效果的主要因素[4]。腫瘤細(xì)胞對放射線的敏感性和許多因素有關(guān)，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的發(fā)生發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解是影響放射敏感性的關(guān)鍵因素。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程的限速酶，它有M1、M2、L、R四種類型，近年來研究最多的是M2型(即PKM2)，研究發(fā)現(xiàn)它與很多腫瘤密切相關(guān)，如胃癌、直腸癌、胰腺癌等[5]，PKM2可以作為一個(gè)分子指標(biāo)預(yù)測放療療效。本研究旨在探討非小細(xì)胞肺癌患者PKM2的表達(dá)情況與放療敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取2013年7月至2014年7月在我院門診就診的非小細(xì)胞肺癌患者68例，所有患者經(jīng)臨床和手術(shù)病理確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例為首診患者，之前未曾接受過內(nèi)分泌、放化療等抗癌治療；(2)患者臨床資料和隨訪記錄完整；(3)患者身體狀況佳可耐受放療。所有患者簽署知情同意書后，且經(jīng)過醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。男40例，女28例；患者年齡 42～66歲，平均年齡(57.11±4.2)歲;癌癥分類：腺癌30例，鱗癌38例；分化程度：高分化11例，中分化34例，低分化23例；臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期32例；吸煙史：有吸煙史41例，無吸煙史27例。根據(jù)患者接受放射治療后疾病緩解情況判斷患者對放療的敏感程度，將所有患者分為A、B組：A組為對放療敏感患者，B組為對患者不敏感患者。分組依據(jù)：放療敏感為完全緩解(CR)+部分緩解(PR)；放療不敏感為疾病穩(wěn)定(NC)+疾病進(jìn)展(PD)。根據(jù)分組要求，A組37例、B組31例，2組患者臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 治療 所有患者于手術(shù)治療后3周左右接受三維放射治療，儀器為美國瓦里安clinac23EX高能電子直線加速器。放射治療實(shí)踐為8周，患者放療結(jié)束后1個(gè)月使用對放療療效進(jìn)行評價(jià)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照RECIST腫瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]：完全緩解(CR)，所有目標(biāo)病灶經(jīng)治療完全消失，并且至少維持4周以上；部分緩解(PR)，基線病灶的最大徑之和至少減少30%，至少維持4周；疾病穩(wěn)定(SD)，基線病灶最大徑之和有減少但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD；疾病進(jìn)展(PD)，基線病灶最大徑之和至少增加25%或出現(xiàn)新病灶。

1.3 免疫組化法檢測放療前后PKM2的表達(dá)情況 病理標(biāo)本來源于放療前手術(shù)切除的腫瘤組織，標(biāo)本處理方法：組織用甲醛固定，石蠟包埋切片；按照免疫組化試劑盒說明書孵育一抗、孵育二抗，并染色，試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。一抗為鼠抗人PKM2抗體、二抗及染色試劑購Santa公司。

1.4RT-PCR檢測PMK2mRNA表達(dá)情況 病理標(biāo)本來源于放療前手術(shù)切除的腫瘤組織，組織標(biāo)本先后進(jìn)行RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，最后凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照，然后用Quantityone凝膠分析軟件進(jìn)行差異分析，整理分析相關(guān)數(shù)據(jù)。PKM2基因引物序列5’-GGGAGCCACTCTCAAAATCA- 3’(上游)；5’-ACCTTTTCTGCTTCACCTGGA-3’(下游)。

1.5Westernblot檢測PKM2蛋白表達(dá)情況 病理標(biāo)本來源于放療前手術(shù)切除的腫瘤組織，進(jìn)行蛋白的提取(Qiagen組織提取試劑盒)、電泳分離(150V穩(wěn)壓)、電轉(zhuǎn)至NC膜(50mA恒流)、封閉以及孵育抗體(一抗、二抗)、顯影以及定影、結(jié)果分析(用ImageQuant1.19對凝膠劑進(jìn)行掃描和定量分析)

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測放療前后PKM2的表達(dá)情況 每張切片于10×40倍鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野進(jìn)行觀察，分別計(jì)數(shù)染色的陽性細(xì)胞占全部癌細(xì)胞的百分比。當(dāng)陽性細(xì)胞率為51%～100%為高表達(dá)，陽性細(xì)胞率小于50%時(shí)則為低表達(dá)。68例中高表達(dá)26例，高表達(dá)率為38.24%，A組和B組高表達(dá)率分別為21.62%(8/37)和58.06%(18/31)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明PKM2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 PKM2蛋白在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)情況

2.2RT-PCR檢測PKM2mRNA表達(dá)情況 用RT-PCR的方法檢測2組PKM2mRNA的表達(dá)。與A組比較，B組PKM2mRNA的表達(dá)明顯上升(P<0.05)，這顯示PKM2mRNA的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，即PKM2mRNA低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者對放射治療更加敏感。見圖1、2。

2.3Westernblot檢測PKM2蛋白表達(dá)情況Westernblot檢測結(jié)果顯示，與B組比較，A組PKM2蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這顯示PKM2 蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，即PKM2 蛋白表達(dá)越高，對放射治療越不敏感。見圖3、4。

3 討論

肺癌是最常見的一種惡性腫瘤，全球統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，該病的發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中位列第一[7]，該病嚴(yán)重威脅患者身心健康，影響患者生活質(zhì)量，全球每年新發(fā)病例高達(dá)135.16萬，在我國肺癌患者占全部腫瘤患者的12%～13%。肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占75%～90%[8]，并且統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的五年無進(jìn)展生存率甚至不到15%，其中臨床分型為Ⅰ期的患者，五年無進(jìn)展生存率也僅僅只有60%左右[9]。臨床醫(yī)生在制定人小細(xì)胞肺癌患者的治療方案時(shí)，放療仍然是必不可少的選擇手段[10]。腫瘤放射治療(放療)是利用各類射線生成機(jī)產(chǎn)生射線、電子線等來治療腫瘤的一種特殊方法。醫(yī)生在制定非小細(xì)胞肺癌放療模式時(shí)，劑量及頻次均參考標(biāo)準(zhǔn)治療規(guī)范的推薦，事實(shí)上，不同腫瘤患者對放射線的敏感性不同，有的治療效果良好，有的則完全沒有效果，甚至還有一部分患者出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[11]。那么，假如在患者接受放療之前我們就能預(yù)測患者的治療效果，就可以針對不同患者設(shè)計(jì)不同的放療方案，提高療效，盡可能的減少患者的不良反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化治療[12]。但是，國內(nèi)外的專家學(xué)者至今沒有找到一個(gè)可以用來預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者放療敏感性的一個(gè)生物標(biāo)志物。

圖1 RT-PCR檢測PKM2 mRNA表達(dá)情況凝膠成像分析儀掃描電泳圖

圖2 RT-PCR檢測PKM2 mRNA表達(dá)情況柱狀分析圖

圖3 Western blot 檢測PKM2蛋白表達(dá)情況

圖4 Western blot 檢測PKM2蛋白表達(dá)情況柱狀分析圖

隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的發(fā)生發(fā)展，研究者們逐漸把研究方向指向有氧糖酵解過程的限速酶PKM2。糖酵解在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它是腫瘤細(xì)胞供能的主要方式，由于糖酵解過程在無氧的環(huán)境下也能進(jìn)行，腫瘤的這種代謝方式賦予了腫瘤細(xì)胞生長的優(yōu)勢[13]。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程的限速酶，它有M1、M2、L、R四種類型，研究發(fā)現(xiàn)PKM2在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)較低[14]。許多研究均證實(shí)，血液及糞便中PKM2的檢測可以明確腫瘤診斷、判斷腫瘤臨床分期以及分析腫瘤是否轉(zhuǎn)移，這一方法可以應(yīng)用于食管癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等[15]，另外還有研究表明PKM2的表達(dá)水平與放療的敏感性密切相關(guān)[16]。

本研究為了證實(shí)探討非小細(xì)胞肺癌患者PKM2的表達(dá)情況與放療敏感性的關(guān)系，檢測放療敏感患者與不敏感患者癌組織中PKM2mRNA及蛋白的表達(dá)水平，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，PKM2蛋白在放療敏感患者和放療不敏感患者的高表達(dá)率分別為21.62%(8/37)和58.06%(18/31)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與A組比較，放療不敏感患者PKM2mRNA的表達(dá)明顯上升(P<0.05)。Westernblot檢測結(jié)果顯示，與放療不敏感患者比較，放療敏感患者PKM2蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這提示PKM2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，即PKM2在癌細(xì)胞中表達(dá)水平越低，患者對放療就越敏感。分析其潛在的機(jī)制，PKM2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中除了調(diào)節(jié)糖酵解之外，還與一些癌基因發(fā)生作用，共同影響腫瘤生長。有研究發(fā)現(xiàn)，PKM2能影響B(tài)ax和Bak的表達(dá)，Bax和Bak是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。近期還有研究發(fā)現(xiàn)，PKM2能通過EGRF通路來調(diào)節(jié)cyclinD1和c-myc的表達(dá)[17]，cyclinD1和c-myc是重要的細(xì)胞增值調(diào)控因子。這些基因均是腫瘤的生長過程的關(guān)鍵因子，因此我們推測腫瘤組織中PKM2的水平不一樣，影響了凋亡基因Bax和Bak以及細(xì)胞增值調(diào)控因子cyclinD1和c-myc的表達(dá)，使得腫瘤組織對放射的敏感性發(fā)生改變。

綜上所述，PKM2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明PKM2 的表達(dá)可以作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者放療敏感性的重要分子標(biāo)志，從而實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療。

1 趙真真,王忠敏,茅愛武.非小細(xì)胞肺癌的介入治療現(xiàn)狀.介入放射學(xué)志,2014,23:272-276.

2KomakiR,TsaoAS,MehranRJ.Non-SmallCellLungCancer.SpringerNewYork,2013.45-62.

3 鐘幸,王瑾.EGFR突變與非小細(xì)胞肺癌放射治療進(jìn)展.中國肺癌雜志,2013,16:157-161.

4WangXC,DuLQ,TianLL,etal.ExpressionandfunctionofmiRNAinpostoperativeradiotherapysensitiveandresistantpatientsofnon-smallcelllungcancer.LungCancer,2011,72:92-99.

5KumarY,MazurekS,YangS,etal.InvivofactorsinfluencingtumourM2-pyruvatekinaselevelinhumanpancreaticcancercelllines.TumourBiol,2010,31:69-77.

6 尹利杰,趙瑩瑩.非小細(xì)胞肺癌組織PKM2 和K-ras基因蛋白表達(dá)及其與放療敏感相關(guān)性的探討.中華腫瘤防治雜志,2010,17:1080-1082.

7JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics.CACancerJClin,2011,61: 69-90.

8ZarogoulidisK,ZarogoulidisP,DarwicheK,etal.Treatmentofnon-smallcelllungcancer(NSCLC).JThoracDis,2013,5:389-396.

9 徐燕梅.血漿miRNAs預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者放療敏感性的研究.第三軍醫(yī)大學(xué).2014.

10BradleyJD,PaulusR,KomakiR,etal.ArandomizedphaseIIIcomparisonofstandard-dose(60Gy)versushigh-dose(74Gy)conformalchemoradiotherapywithorwithoutcetuximabforstageIIInon-smallcelllungcancer:ResultsonradiationdoseinRTOG0617.JClinOncol,2013,31:7501.

11WangXC,DuLQ,TianLL,etal.ExpressionandfunctionofmiRNAinpostoperativeradiotherapysensitiveandresistantpatientsofnon-smallcelllungcancer.LungCancer,2011,72:92-99.

12 崔爽爽.MicroRNA表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌放療敏感性關(guān)系的研究.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,19:565-569.

13 周成富.丙酮酸激酶亞型的表達(dá)上調(diào)對大腸癌細(xì)胞糖代謝和腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的影響.中山大學(xué)學(xué)報(bào),2012,33:481-483.

14ChanetonB,GottliebE.Rockingcellmetabolism:revisedfunctionsofthekeyglycolyticregulatorPKM2incancer.TrendsBiochemiSci,2012,37:309-316.

15 錢澤.PKM2在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)及其致癌作用.浙江大學(xué)，2015.

16 尹晨希,周菲菲,夏良平.惡性腫瘤患者血清中PKM2水平的診斷和預(yù)后預(yù)測價(jià)值.腫瘤學(xué)雜志,2013,19:565-569.

17 呂磊,汪良,蔣國松,等.沉默PKM2 增強(qiáng)藤黃酸誘導(dǎo)人前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡的敏感性.中國男科學(xué)雜志,2013,19:102-106.

Expression of PKM2 in non-small cell lung cancer and its correlation with radiotherapy sensitivity

WANGWeixing,YANGBo,YULifang,etal.

DepartmentofOncology,WuhanGeneralHospitalofPLA,Wuhan430070,China

Objective To investigate the expression of PKM2 in non-small cell lung cancer and its correlation with radiotherapy sensitivity.Methods Sixty-eight patients with non-small cell lung cancer who were treated in our hospital from July 2013 to July 2014 were enrolled in the study. All the patients were diagnosed by clinical and operative pathology and were treated by radiotherapy. According to radiotherapy sensitivity,these patients were divided into group A (sensitivity to radiotherapy) and group B (non-sensitivity to radiotherapy).The expression levels of PKM2 in surgical ablation tumor tissues before radiotherapy were detected by immunohistochemistry,the expression levels of PKM2 mRNA were detected by RT-PCR and the expression levels of PKM2 protein were detected by Western Blot.Results The immunohistochemistry examination showed that the high expression rate of PKM2 in group A and group B was 21.62%(8/37)and 58.06%(18/31), respectively,there was a significant difference between two groups (P<0.05).TheresultsbyRT-PCRshowedthattheexpressionlevelsofPKM2mRNAingroupBweresignificantlyincreased,ascomparedwiththoseingroupA(P<0.05).WesternBlottingrevealedthattheexpressionlevelsofPKM2proteiningroupAwereobviouslydecreased,ascomparedwiththoseingroupA(P<0.01).Conclusion The expression of PKM2 is negatively correlated with radiotherapy sensitivity,which shows that the expression of PKM2 can be regarded as an important molecular mark to predict radiotherapy sensitivity in patients with non-small cell lung cance so as to realize individualized treatment.

PKM2；non-small cell lung cancer; radiotherapy sensitivity

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.006

項(xiàng)目來源：湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：2012FFA071)

430070 武漢市，中國人民解放軍武漢總醫(yī)院腫瘤科

饒智國，430070 武漢市，中國人民解放軍武漢總醫(yī)院腫瘤科；

E-mail:raozhiguo@hotmail.com

R

A

1002-7386(2017)04-0504-04

2016-06-12)