促紅細胞生成素和氨甲酰化衍生物對慢性心力衰竭大鼠抗心肌細胞凋亡及機制的研究

黃兆琦 許衛 伍金雷 陳勝強 陳晞明

·論著·

促紅細胞生成素和氨甲酰化衍生物對慢性心力衰竭大鼠抗心肌細胞凋亡及機制的研究

黃兆琦 許衛 伍金雷 陳勝強 陳晞明

目的 探究促紅細胞生成素(EPO)及氨甲酰化抗慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的保護作用及其可能的機制。方法 將39只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、EPO組及CEPO組。所有大鼠均采用腹腔注射異丙腎上腺素法建立大鼠心力衰竭模型。干預4周后，檢測3組大鼠血流動力學指標變化，血清中iNOS、SOD水平及心肌細胞凋亡情況并計算凋亡指數(AI)和心肌細胞凋亡率。結果 與對照組比較，EPO組與CEPO組LVSP、±dp/dtmax均顯著提高，而HR及LVEDP顯著下降，差異有統計學意義(P<0．05)；EPO組與CEPO組間血流動力學指標變化差異有統計學意義(P<0．05)；EPO組與CEPO組SOD水平與對照組比較顯著上升(P<0．05)，而iNOS水平顯著下降(P<0．05)；EPO組與CEPO組間iNOS、SOD水平差異有統計學意義(P<0．05)；3組大鼠心肌細胞凋亡指數以對照組最高(36.53%)，EPO組次之(23.73%)，CEPO組最低(19.64%)，心肌細胞凋亡指數差異有統計學意義(P<0．05)；3組大鼠不同時間點心肌細胞凋亡率按照對照組、EPO組及CEPO組的順序依次降低，差異有統計學意義(P<0．05)。結論 EPO及CEPO可有效改善CHF大鼠的心功能，抑制心肌細胞凋亡CEPO的功效要優于EPO，其發生機制可能與機體內血清中的iNOS及SOD水平有關。

促紅細胞生成素；氨甲酰化；慢性心力衰竭；機制

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由腎臟和肝臟分泌的細胞因子，具有促進紅細胞生成的作用。大量研究證實，EPO除了具有造血活性外，對機體多種組織器官(如心臟、腎臟及視網膜等)具有保護作用，可以減少相關組織器官的細胞凋亡、抑制炎性反應、以及促進血管生長和功能恢復[1]。但長期或者大劑量EPO使用可能會引發紅細胞增多癥、高血壓及血栓形成等不良反應[1]。EPO經氨甲酰化而產生的衍生物—氨甲酰化促紅細胞生成素(CEPO)，同樣具有保護機體組織器官的作用，但卻不表現任何促紅細胞生成活性，因此可以有效避免高血壓及血栓形成等不良反應。慢性心力衰竭(CHF)是臨床上各種類型心臟病的最終結局，其主要發病機制是由于心肌梗死、心肌病、血流動力學負荷過重、炎癥等引起的持續性的心肌損傷。眾多實驗已經證實了EPO及CEPO對心肌組織的保護作用[2]，但在CHF中的心肌保護作用相關報道較少。本文建立大鼠CHF模型，予以EPO及CEPO干預，以探究EPO及CEPO抗慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的保護作用及其可能的機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠100只，購于蘭州大學醫學實驗動物中心(合格證號：44007200017850)，清潔級，體重(230±20)g。大鼠實驗前適應環境1周，自由飲食，飼養室內溫度為(23±2)℃，相對濕度65%，給予標準通風及照明條件[3]。實驗過程中對動物的處置均符合動物倫理學標準。

1.2 主要試劑、藥品 EPO：沈陽三生制藥公司，規格10 000 U/ml；CEPO：Warren Pharmaceuticals公司；鹽酸異丙腎上腺素注射液(ISO)：上海禾豐制藥有限公司，規格1 ml/支；原位細胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒：羅氏(Roche)公司；NOS(分型)測定試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；SOD測定試劑盒：北京博邁斯科技發展有限公司。

1.3 實驗方法 將100只SD大鼠腹腔注射異丙腎上腺素(ISO)5 mg/kg，1次/d，連續3 d造模[4]。喂養5周后，造模大鼠死亡15只，其中腹腔注射異丙腎腺素后前3 d分別死亡6、4、3只，之后5周時間內死亡2只。對存活的大鼠進行造模成功判定，以左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mm Hg提示CHF模型構建成功[5]。經檢測，共有46只存活大鼠的LVEDP<15 mm Hg，提示CHF模型構建失敗。而除掉造模失敗，術中及術后死亡的大鼠，共有39只大鼠造模成功。將造模成功大鼠隨機分為對照組、EPO組、CEPO組，每組13只。EPO組予以50 μg/kg EPO腹腔注射，2次/周，持續4周；CEPO組予以腹腔注射CEPO 50 μg/kg[6]，2次/周，持續4周[7]；對照組予以腹腔注射50 μg/kg 0.9%氯化鈉溶液。所有SD大鼠腹腔注射時均應注意回抽，避免進入血管、膀胱及腸管。持續干預4周后進行試驗指標的測定。

1.4 檢測指標 (1)干預4周后，于最后一次給藥后禁食水12 h，稱重，穿刺右側頸總動脈，并植入內含0.1%肝素、直徑1 mm、末端帶有微壓力傳感器的聚乙烯導管，連接BL-410S生物機能實驗系統，記錄血流動力學指標，包括心率(HR)、LVEDP、左心室內壓峰值(LVSP)、左心室內壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)[8]。(2) 血流動力學指標測定完成后，于右側頸總動脈插管處留取血樣本2 ml置于抗凝管中，室溫靜置15 min后于常溫下3 000 r/min離心10 min，留取上清液，置于-70℃冰箱備用[8]。然后按照上海酶聯生物科技有限公司的NOS(分型)測定試劑盒及北京博邁斯科技發展有限公司的SOD測定試劑盒說明分別檢測血清中iNOS、SOD水平。(3)檢測心肌細胞凋亡情況并計算凋亡指數(AI)和心肌細胞凋亡率。用TUNEL 試劑盒檢測心肌細胞凋亡情況，具體方法：從已制成的石蠟切片中，各組隨機取3張切片，按照 TUNEL 試劑盒操作方法檢測心肌細胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞熒光顯色并采取圖像，再進行 DAB 顯色，每張切片在高倍鏡(×400)下隨機讀取6個不重疊視野，以細胞核中有染成棕色為陽性細胞。計數后，計算細胞凋亡指數(AI)=單視野凋亡陽性細胞數/單視野總細胞計數×100%，取其平均值進行統計分析[9]；心肌細胞凋亡率的測定：選取相應部位，每片選分布均勻的5個視野作為觀察區。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行定量分析[10]。

2 結果

2.1 SD大鼠一般情況 對照組、EPO組及CEPO組各出現1只大鼠死亡，對照組死亡原因考慮為心力衰竭加重，而EPO組及CEPO組死亡大鼠經解剖后診斷死因為腸粘連；3組大鼠均先后出現精神不振、進食不佳、毛色枯澤甚至出現脫毛、口唇紫紺等心力衰竭癥狀，按照對照組、EPO組及CEPO組的順序3組大鼠心衰癥狀總體上依次減輕。

2.2 血流動力學變化情況 與對照組比較，EPO組與CEPO組的LVSP、±dp/dtmax有了顯著提高，而HR及LVEDP顯著下降，差異有統計學意義(P<0．05)。見表1。

表1 3組大鼠血流動力學變化比較 ±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與EPO組比較，#P<0.05

2.3 血清iNOS及SOD水平測定EPO組與CEPO組SOD水平與對照組比較有顯著上升(P<0．05)，而iNOS水平顯著下降(P<0．05)；EPO組與CEPO組iNOS、SOD水平差異有統計學意義(P<0．05)。見表2。

組別iNOSSOD對照組29．73±0．9844．23±3．74EPO組25．63±1．23?47．35±3．56?CEPO組22．23±1．51?#51．95±3．42?#

注：與對照組比較，*P<0.05；與EPO組比較，#P<0.05

2.4 心肌細胞凋亡率及凋亡指數情況 3組大鼠心肌細胞凋亡指數以對照組最高(36.53%)，EPO組次之(23.73%)，CEPO組最低(19.64%)，心肌細胞凋亡指數差異有統計學意義(P<0．05)；3組大鼠不同時間點心肌細胞凋亡率按照對照組、EPO組及CEPO組順序依次降低，差異有統計學意義(P<0．05)。見圖1，表3。

圖1 3組心肌細胞凋亡指數比較(%)

表3 3組大鼠不同時間點心肌細胞凋亡率±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與EPO組比較，#P<0.05

3 討論

心臟功能的改變(如心臟收縮及舒張功能的異常、心臟供血供氧狀況以及心室壁張力大小等)，可以從心肌細胞血流動力學指標的變化中反映出來。目前常采用一些速率指標來評價心肌收縮和舒張能力，如-dp/dtmax和LVEDP是心肌早期舒張功能改變的敏感指標。+dp/dtmax和LVSP常作為評價心肌收縮能力的重要指標[11]。本實驗研究結果顯示，與對照組比較，EPO組與CEPO組LVSP、±dp/dtmax有顯著提高，而HR及LVEDP有顯著下降。EPO及CEPO對反映心臟收縮功能的LVEDP、+dp/dtmax和反映心臟舒張功能的LVEDP、-dp/dtmax改善情況顯著，提示EPO及CEPO可以有效加強心肌收縮力，降低舒張末期容積和壓力，改善心臟血流動力學，進而改善機體心臟功能。并且，CEPO的效果明顯優于EPO。而王鋒等[8，11]的研究也與本研究結果類似。

有研究顯示，EPO對心肌細胞的保護作用依賴于其抗凋亡的作用[12]。而本研究對各組大鼠心肌細胞凋亡情況的監測顯示，各組大鼠心肌細胞凋亡指數以對照組最高，EPO組次之，CEPO組最低；不同時間點心肌細胞凋亡率按照對照組、EPO組及CEPO組的順序依次降低。結果提示EPO及CEPO抗細胞凋亡的作用。張麗等[13]的研究也與本研究結果類似。此外，多數研究認為EPO及CEPO抗細胞凋亡作用與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、PKC、mltoKATP、酪氨酸激酶(JAK2)及一氧化氮合酶(NOS)等激活有關[14]。其中的一氧化氮合酶(NOS)是合成NO的關鍵酶之一。近些年研究發現，NO除了具有擴張血管、抗血小板聚集、粘附以及作為炎性介質和細胞毒性等作用，高濃度的NO能夠抑制心肌收縮力，而低濃度的NO則能增加心肌收縮力。而合成NO的關鍵酶一氧化氮合酶(NOS)分為兩型：原生型一氧化氮合酶(cNOS)和iNOS。本研究通過測定3組大鼠血清iNOS及SOD水平探究EPO及CEPO抗細胞凋亡可能的機制，研究結果顯示，EPO組與CEPO組iNOS水平與對照組比較顯著下降。王鋒等[8]認為，慢性心力衰竭患者機體內iNOS含量較高，而cNOS含量降低，因此導致機體內NO含量明顯升高。而高濃度的NO可損壞線粒體能量代謝，抑制細胞增殖，破壞心肌細胞內DNA結構，進而促進細胞凋亡；另一方面，由于NO的細胞毒性作用，細胞代謝活動受到影響，細胞呼吸鏈及酶的活性受到干擾，而使DNA降解的酶被激活，進而導致心肌細胞的凋亡，而心肌細胞的凋亡則會進一步惡化CHF。而楊麗霞等[15]的研究認為iNOS過度表達會導致產生大量NO，大量NO在胞漿內形成大量的過氧化硝酸亞鹽，并最終形成激活多肽(ADP-核糖)聚合酶導致細胞凋亡。這些研究都證實了心肌細胞的凋亡與NOS不可分割的關系。

本研究監測的另一項指標SOD是體內清除OFR最主要的酶，而OFR可通過與細胞膜及細胞器膜的多價不飽和酸發生反應而導致細胞損傷。因此，當機體內OFR水平過高時，細胞的功能及結構會受到破壞，機體的代謝也會因此紊亂。尤其是過高的OFR還可損傷血管內皮細胞，使血管內舒張因子合成減少，活性減弱，進而加速CHF的進程[8]。本研究結果中EPO

組與CEPO組SOD水平與對照組比較顯著上升，SOD含量水平越高，機體內OFR含量就會越低，細胞受到的損害及CHF進程也會因此減輕。實驗中EPO組及CEPO組細胞凋亡率的降低以及相應血流動力學的改變也證實了這一點。

綜上所述，本研究通過建立CHF大鼠模型，發現EPO及CEPO可有效改善CHF大鼠的心功能，抑制心肌細胞凋亡，其發生機制可能與機體內血清中的iNOS及SOD水平有關。但其抗凋亡作用機制較為復雜，仍需進一步精確驗證與研究。

1 林雪梅,馬玉姍.氨甲酰化的促紅細胞生成素研究進展.華西醫學,2007,22:678-679.

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5TnnessenT,ChristensenG,OieE,etal.Increasedcardiacexpressionofendothelin-1mRNAinischemicheartfailureinrats.CardiovascularResearch,1997,33:601-610.

6FiordalisoF,ChimentiSL,BaiA,etal.Anonerythropoieticderivativeoferythropoietinprotectsthemyocardiumfromischemiareperfusioninjury.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2005,102:2046-2051.

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8 王鋒,張麗,崔麗君,等.氨甲酰化促紅細胞生成素抗大鼠慢性心力衰竭的實驗研究.山東醫藥,2011,51:31-33.

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10 馬寶新.促紅細胞生成素及其衍生物抗癲癇大鼠心肌細胞凋亡及機制的研究.吉林大學學報,2009,35:55-56.

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12MoonC,KrawczykM,AhnD,etal.Erythropoietinreducesmyocardialinfarctionandleftventricularfunctionaldeclineaftercoronaryarteryligationinrats.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100:11612-11617.

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Study on the protective effects and possible mechanism of erythropoietin and carbamoylation on cardiomyocytes apoptosis of rats with chronic heart failure

HUANGZhaoqi,XUWei,WUJinglei,etal.

DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China

Objective To investigate the protective effects and possible mechanism of erythropoietin (EPO) and carbamoylation on cardiomyocytes apoptosis of rats with chronic heart failure (CHF).Methods Thirty-nine healthy male SD rats were randomly divided into control group,EPO group and CEPO group.The animal models with heart failure were established by intraperitoneal injection with ISO-epinephrine in all the rats.After 4-week intervention,the changes of hemodynamic parameters,the serum levels of iNOS and SOD as well as apoptotic index (AI) and apoptosis rate of myocardial cells were detected and calculated.Results As compared with those in control group, LVSP and ±dp/dtmax in EPO group and CEPO group were significantly increased,however, HR and LVEDP were significantly decreased (P<0.05).ThereweresignificantdifferencesinhemodynamicparametersbetweenEPOgroupandCEPOgroup(P<0.05).Ascomparedwiththoseincontrolgroup,SODlevelsinEPOgroupandCEPOgroupweresignificantlyincreased(P<0.05),however,iNOSlevelsweresignificantlydecreased(P<0.05).ThereweresignificantdifferencesiniNOSandSODlevelsbetweenEPOgroupandCEPOgroup(P<0.05).Amongthethreegroups,theAIincontrolgroupwasthehighest(36.53%),thenextinorderEPOgroup(23.73%),whichinCEPOgroupwasthelowest(19.64%),therewasasignificantdifferenceinAIamongthethreegroups(P<0.05).Moreoverthedecreaseorderofapoptosisrateindifferenttimepointswascontrolgroup,EPOgroup,CEPO(P<0.05).Conclusion The EPO and CEPO can effectively improve the cardiac function of rats with CHF,and the inhibition efficiency of CEPO is superior to that of CPO,and its action mechanism may be related to the changes of serum levels of iNOS and SOD.

erythropoietin; carbamoylation; chronic heart failure; mechanism

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.001

項目來源：廣東省科學技術研究與發展指導計劃項目(編號：2013B022000103)

510150 廣州市，廣州醫科大學附屬第三醫院心內科(黃兆琦、許衛、伍金雷、陳晞明)；廣州醫科大學附屬第二醫院(陳勝強)

R 541.6

A

1002-7386(2017)04-0485-04

2016-08-10)