隴馬陸配伍中藥抑制幽門螺桿菌作用的實驗研究

趙曰超　王禮　徐媛媛

【摘要】 目的：探討隴馬陸分別與紅芪、黃連、紅景天、馬齒莧、蒲公英配伍后的抗幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）作用以及藥物間是否有協同效應。方法：采用水提法和醇提法提取上述藥物配方及隴馬陸、紅景天和黃連單藥的有效成分，應用紙片瓊脂擴散法篩選上述配方對Hp的抑制作用；建立Hp液體培養模型，采用稀釋法測定隴馬陸、黃連、紅景天單藥及復方提取物的抗Hp最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），并比較藥物間配伍后的協同效應。結果：隴馬陸與紅芪、紅景天、黃連、馬齒莧、蒲公英藥配伍后對Hp均有抑制作用，以與黃連配伍后抑制作用最強；隴馬陸、黃連、紅景天、隴馬陸-黃連、隴馬陸-紅景天對Hp的MIC分別為20～40、0.63～1.25、1.25～2.50、1.25～2.50、10～20 mg/mL；與隴馬陸配伍后，黃連和紅景天的抗Hp MIC僅為單藥的1/2倍。結論：隴馬陸分別與紅芪、紅景天、黃連、馬齒莧、蒲公英配伍對Hp均有一定的抑菌作用；隴馬陸與黃連、紅景天配伍后可產生抗Hp的協同效應；Hp液體培養稀釋法可以有效判斷中藥的抗Hp效能。

【關鍵詞】 隴馬陸； 黃連； 紅景天； 幽門螺桿菌； 最小抑菌濃度； 協同效應

【Abstract】 Objective：To study the bacteriostasis against Helicobacter pylori（Hp） of the compounds of Kronopolites Svenhedini with Hedysarum polybotrys，Rhodiola Rosea，Rhizoma Coptidis，Portulaca Olerace，Taraxacum Mongolicum respectively and the synergies among these Chinese Medicines.Method：The effective ingredients of the several Kronopolites Svenhedini compounds and the single drug of Kronopolites Svenhedini，Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea were extracted by water decoction extraction and ethanol extraction respectively.The bacteriostasis of the mentioned compounds against Hp were screened by disc agar diffusion.The liquid model for Hp culturing was established.Minimum inhibitory concentration（MIC） of the Kronopolites Svenhedini，Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea and the formulations mentioned above against Hp were mearsured by serial dilution method and the synergies between two drugs of the compounds were compared.Result：The compounds of Kronopolites Svenhedini with Hedysarum Polybotrys，Rhodiola Rosea，Rhizoma Coptidis，Portulaca Olerace，Taraxacum Mongolicum respectively all exhibited bacteriostasis against Hp and the most powerful compound among them was Kronopolites Svenhedini accompanied with Rhizoma Coptidis.MIC of Kronopolites Svenhedini，Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea，Kronopolites Svenhedini-rhizoma Coptidis，Kronopolites Svenhedini-rhodiola Rosea were respectively 20-40，0.63-1.25，1.25-2.50，10.00-20.00 mg/mL.When combined with Kronopolites Svenhedini，MIC against Hp of Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea were half lower than those of the single herbs.Conclusion：Compounds of Kronopolites Svenhedini with Hedysarum Polybotrys，Rhodiola Rosea，Rhizoma Coptidis，Portulaca Oleracea，Taraxacum Mongolicum respectively all have bacteriostasis against Hp.Kronopolites Svenhedini companied with Rhizoma Coptidis or Rhodiola Rosea can produce synergy when they are used to eliminate Hp.Hp liquid culture dilution method can effectively determine the anti-Hp potency of traditional Chinese medicine.

【Key words】 Kronopolites Svenhedini； Rhizoma Coptidis； Rhodiola Rosea； Helicobacter pylori； Minimum inhibitory concentration； Synergy

First-authors address：The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China；Department of Pathogenic Biology of Lanzhou University Lanzhou 730000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.011

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是引發胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素，而且與胃惡性腫瘤的發生密切相關[1]。Hp在人群中的感染率很高，我國人群Hp的現癥感染率為42%～64%[2]。第四次全國Hp感染處理共識報告指出，Hp陽性的消化性潰瘍（不論是否活動和有無并發癥史）與胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤（MALT）強烈推薦根除Hp[3]。有研究表明，在根除Hp的治療中，使用含克拉霉素的三聯療法的根除率為78.3%，使用含鉍劑的四聯療法的根除率為77.0%[4]，并且耐藥率呈現上升趨勢[5]。亟待尋找新的有效根除Hp的藥物以應對Hp的耐藥。

中藥在治療慢性胃炎和消化性潰瘍中的療效早已確認。隴馬陸[Kronopolites Svenhedini（Verhoeff）]為甘肅省道地藥材，具有利濕止痛、和中開胃的功效[6]，隴馬陸胃藥片治療胃潰瘍效果顯著[7]，動物實驗證明有抑制胃酸及保護胃黏膜的作用[8-9]。中藥在臨床上往往以復方的形式使用，藥物間的協同作用在治療中發揮重要作用。本文通過篩選隴馬陸分別與紅芪、紅景天、黃連、馬齒莧、蒲公英配伍后對Hp的抑制作用后，將隴馬陸與黃連或紅景天進行單藥及復方抗Hp最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定，準確判斷上述中藥的抗Hp作用效能及藥物間的協同作用，為開發抗Hp中藥、中藥臨床抗Hp治療提供理論支持，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 Hp J99，來源于蘭州大學菌種保藏中心。

1.1.2 實驗用中藥材 隴馬陸（產地甘肅），紅芪（產地甘肅），紅景天（產地西藏），黃連（產地四川），馬齒莧（產地安徽），蒲公英（產地甘肅）。隴馬陸購自蘭州大學第二醫院藥房，紅芪、紅景天、黃連、蒲公英均購自蘭州百寶藥業有限公司。

1.1.3 主要儀器與試劑 HERAcell?240iCO2培養箱（Thermo）；生物安全柜（HFsafe-1200）；水平搖床（IKA-KS260）；調溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（BUCHI）；SHZ-D（Ⅲ）循環水真空泵（鄭州英峪予華儀器有限公司）；快速混勻器（常州國華電器有限公司）；高速冷凍離心機（Thermo BIOFUGE STRATOS）；紫外分光光度計（Thermo Scientific BioMate 3S）；手提式多功能粉碎機（上海長沙工貿有限公司）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；-80 ℃冰箱（Thermo）；電子天平（Sartorius）。Hp快速尿素酶診斷試劑盒（福建三強）；羊血（南京便診）；新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；哥倫比亞瓊脂（BD）；腦心浸液（BD）；革蘭染色液（海博生物）。

1.2 方法

1.2.1 中藥配伍 以隴馬陸為基礎藥物，依據臨床用中藥量，分別按如下比例進行藥物配伍，隴馬陸與紅芪2∶3，隴馬陸與紅景天1∶1，隴馬陸與黃連1∶1，隴馬陸與馬齒莧1∶2，隴馬陸與蒲公英1∶2。

1.2.2 中藥提取與濃縮 采用水提法和醇提法提取中藥的有效成分。（1）水提法：采用加熱回流法提取。將每味中藥使用粉碎機粉碎后，按照前述配伍原則進行混合，稱取每個配方藥物混合物5 g，加入40 mL超純水，浸泡約12 h后使用回流法加熱1 h，離心后取上清，向藥渣中再加入40 mL超純水，再次回流法加熱1 h，離心后取上清，合并兩次藥液，蒸發濃縮后用超純水定容至25 mL，使每毫升液體含生藥0.2 g。單味藥物的水提法提取同前。（2）醇提法：采用超聲萃取法。將每味中藥使用粉碎機粉碎，同前按比例進行混合，稱取配方藥物混合物5 g，加入75%酒精40 mL，浸泡約12 h后置超聲波清洗器中（25 ℃，80 W）1 h，使用循環水真空泵抽濾，去除藥渣，將藥液蒸發濃縮，超純水定容至10 mL，使每毫升藥液含生藥0.5 g。

1.2.3 中藥的滅菌 水提物使用0.22 μm濾器除菌；醇提物采用100 ℃，加熱1 h除菌后，吸取少量醇提物加入營養肉湯中，振蕩培養48 h后觀察滅菌效果，以培養液清亮為滅菌。

1.2.4 培養基制備 （1）Hp固體平板培養基：稱取4.25 g哥倫比亞瓊脂（BD），溶于100 mL超純水中，高壓滅菌后，加入10%葡萄糖5 mL及無菌脫纖維綿羊血7 mL，混勻后倒入無菌平皿，凝固后使用封口膜封口，置4 ℃冰箱備用。（2）Hp液體培養基：稱取3.7 g腦心浸液干粉（BD），溶于100 mL超純水中，高壓滅菌后，加入10%葡萄糖5 mL及滅活的新生牛血清10 mL，混勻后置4 ℃冰箱備用。

1.2.5 Hp復蘇、鑒定和液體培養 將-80 ℃凍存Hp J99分區劃線接種Hp固體平板培養基上，置三氣培養箱中（10%CO2，5%O2，85%N2）37 ℃培養3 d。經Hp快速尿素酶試驗和革蘭染色形態觀察鑒定后，挑取單菌落接種至Hp液體培養基，置三氣培養箱中，37 ℃，振蕩（100 轉/min）培養。

1.2.6 紙片瓊脂擴散法篩選有抑制Hp作用的中藥配伍 將液體培養48 h的Hp均勻涂布于Hp固體平板培養基表面后，將直徑6 mm的無菌濾紙片貼至平板表面。吸取已提取藥液10 μL滴至紙片中央，同時設置未加藥的空白紙片對照，平板加樣后置三氣培養箱中37 ℃培養72 h，測量抑菌圈直徑大小。

1.2.7 有抑菌作用中藥對Hp的MIC測定 將1.2.6篩選出的有一定抑菌作用的配方及單味藥提取物進行MIC測定。配置Hp液體培養基，按照倍比稀釋法將藥物濃度逐層稀釋同時設不含藥的空白培養基作對照。由于藥液自身顏色等因素的影響，同一藥物濃度梯度設置接種Hp及不接種Hp的對照（以隴馬陸MIC測定為例，見表1）。將培養至穩定期的Hp菌液1∶100接種至培養基中，使Hp初始濃度控制在106～107 cfu/mL范圍，將接種Hp后的培養基放入三氣培養箱中37 ℃振蕩培養48 h，以未接種Hp含藥對應濃度培養基調零后，測定同一藥物濃度梯度接種Hp后培養液的光密度（optical density，OD）600值，若OD值變化明顯，則證明有Hp生長。以此來判斷藥物干預Hp的MIC。

1.2.8 隴馬陸與黃連素或紅景天的抗Hp協同作用測定 向液體培養基中加入低于MIC濃度的隴馬陸水提物，測在此條件干預下的黃連、紅景天水提物對Hp的MIC范圍（以隴馬陸與黃連協同性測定為例，見表2）。測定方法如1.2.7中所述。

2 結果

2.1 隴馬陸配伍不同中藥抑制Hp作用的初篩結果 隴馬陸與以上5種中藥配伍，經過水煎提取或醇提取后提取物均顯示出對Hp抑菌效果（隴馬陸與紅景天醇提取物對抑菌圈結果有干擾）。為進一步明確上述中藥的抑制Hp作用及抑菌效力，進行了隴馬陸、黃連、紅景天單藥及不同配伍的抑制Hp MIC測定。見表3。

2.2 隴馬陸、黃連、紅景天單藥及配伍水提物對Hp的MIC測定 無論隴馬陸、黃連、紅景天單藥還是隴馬陸與黃連或紅景天的配伍水提物，均對Hp有一定抑制作用，且以黃連提取物的抑菌效力最好，見表4。

2.3 隴馬陸配伍黃連素或紅景天的抑制Hp的協同作用測定 在含有抗Hp1/2MIC濃度的隴馬陸液體培養基中，黃連水提物、紅景天水提取物對Hp的MIC均低于空白液體培養基中對Hp的MIC，表明隴馬陸和黃連素或紅景天配伍抗Hp均具有協同作用，見表5。

3 討論

幽門螺桿菌（Helicobacter pylow，Hp）感染是引發上消化道疾病的重要原因，根除Hp已成為治療慢性胃炎、消化性潰瘍的重要措施。目前根除Hp方案中所用抗生素許多易產生耐藥性。許多中藥具有廣譜的抗菌成分，從中藥中可以發掘抗Hp的藥物，不同中藥的配伍使用是中藥臨床用藥的重要特征。在本次研究中，使用了兩味藥物的聯合配伍篩選抗Hp作用，兩味中藥的配伍易于探明不同中藥的抗Hp作用，同時兼顧藥物復方的特點。臨床實踐已經證明，隴馬陸分別與紅芪、紅景天、黃連、馬齒莧、蒲公英適量配伍可用于治療胃炎及消化性潰瘍。本文的研究發現，隴馬陸分別與紅芪、黃連、馬齒莧、蒲公英適量配伍后的水提取物和醇提取物，隴馬陸與紅景天的水提取物均顯示出一定的抗Hp活性，上述結果間接驗證隴馬陸與相應中藥配伍治療胃部疾病可能與清除Hp感染相關。

隴馬陸是一味常見動物藥，其中的成分苦杏仁味苯甲醛具有廣譜的抗菌作用[6]，提取出的殼聚糖對部分革蘭陽性和革蘭陰性細菌有著不同程度的抑菌作用[10]。有研究表明，由隴馬陸中提取的隴馬陸素或者殼聚糖對Hp有抑制作用[11-12]。紅芪歸肺、脾經，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿以及斂瘡生肌等功能[13]，有抗炎、抗病毒作用[14]，有關抗菌方面的功能研究較少，其同科不同屬的黃芪具有一定的抑菌作用[15]。本實驗發現隴馬陸與紅芪配伍后對Hp有一定的抑制作用，可為Hp感染相關性疾病的治療提供參考。紅景天在某些方劑中作為清熱、滋補元氣的功效使用[16]，現代藥理學研究其具有抗氧化[17]、抗病毒的作用[18]，其脂溶性成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白假絲酵母菌等具有良好的抑菌殺菌作用[19]，且副作用較小，于1991年被衛生部批準為新食品資源[20]。本研究發現紅景天對Hp也有較強的抑殺作用。黃連具有清熱解毒、燥濕殺蟲等功效，蒲公英具有清熱解毒，消腫散結，清利濕熱的功效[21]，兩者均歸胃經[22]，有實驗證實均有廣譜抑菌效果，黃連對革蘭陽性球菌及腸道菌的抑菌作用較強[23]，蒲公英有效抑制炎癥作用的成分可能為黃酮類、多糖類以及酚酸類物質[24]。有方劑含黃連、蒲公英等治療Hp感染患者有效[25]。本實驗從體外實驗角度證實黃連、蒲公英與隴馬陸配伍后均有抑制Hp的作用，尤其黃連的抑菌效果明顯。馬齒莧具有清熱解毒、涼血止血的功效，用于治療熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒等[26]，其含有的黃酮類物質對熱穩定[27]，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、酵母菌等均有較好的抑制效果[28]。有動物實驗表明，馬齒莧通過抑制胃蛋白酶活性、減少胃酸分泌等因素來起到抗胃潰瘍的作用[29]。本實驗表明其與隴馬陸配伍后也有抗Hp的作用，可能也是促進胃潰瘍治愈的機制之一。

為進一步探討隴馬陸、黃連、紅景天單藥及配伍后復方的抗菌效能，本文采用了稀釋法測定了三種藥物單藥及配伍后對Hp的MIC。Hp為微需氧菌，液體培養難度較大，本文在建立了Hp在液體培養基中良好的生長條件后，采用國際上常用抗菌藥物MIC測定的稀釋法，評價了目的藥物的抗Hp效能，進一步證明三種藥物單藥及其不同的配伍均具有一定的抗Hp作用。同時本實驗所用方法為今后篩選和鑒定中藥抗Hp的效能提供了參考依據。

配伍藥物之間可在藥代動力學效應及藥效動力學效應的影響下[30]，實現比單藥使用時更優的功效或者更低的副作用。本文的實驗證實，在含有低于抗Hp1/2MIC的隴馬陸液體培養基中，黃連或紅景天單藥的抗Hp效能顯著增加，表現為MIC明顯低于在Hp空白液體培養基中抗Hp的MIC，表明隴馬陸與黃連及隴馬陸與紅景天之間在抑制Hp時有一定的協同效應。

綜上所述，隴馬陸分別與紅芪、紅景天、黃連、馬齒莧、蒲公英配伍對Hp均有一定的抑菌作用；隴馬陸與黃連、紅景天之間存在抗Hp的協同效應。中藥治療胃炎、消化性潰瘍機制復雜，本研究通過對Hp的抑制作用方面為臨床用藥提供了一定的理論基礎。

致謝：衷心感謝蘭州大學第二醫院中西醫結合科的劉寶厚教授提供的中藥配伍方劑。

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（收稿日期：2016-12-12） （本文編輯：程旭然）