6 292份臍帶血的微生物檢測結果分析

張 晉,佟海俠,馬良艷,王殿昌,段小晶

(中國醫科大學附屬盛京醫院遼寧省臍血庫，沈陽 110022)

6 292份臍帶血的微生物檢測結果分析

張 晉,佟海俠△,馬良艷,王殿昌,段小晶

(中國醫科大學附屬盛京醫院遼寧省臍血庫，沈陽 110022)

目的 探討臍帶血采集和處理過程中微生物污染的概率、種類，并分析臍帶血收集相關因素和檢測方法對培養結果的影響。方法 抽取2011～2014年臍帶血分離后的血漿-紅細胞懸液，分別注入需氧和厭氧培養瓶，使用BACTEC9000系列全自動血液培養系統培養5d，結果陽性者做廢棄處理。對陽性標本進行病原菌鑒定，同時比較不同生產方式、采集者、采集量、采集方式、處理前時間、培養體積、延遲上機時間及培養瓶種類對微生物污染率的影響。結果 6 292份被檢臍帶血中陽性標本131份，污染率為2.1%。病原菌以大腸埃希菌最為常見，占23.9%，其次為凝固酶陰性葡萄球菌，占20.9%。自然分娩者臍帶血標本、縣市級醫院采集標本、采集量低于80mL的標本陽性檢出率升高，培養體積由10mL提高為20mL后陽性檢出率上升，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 臍帶血微生物污染率與生產方式、采集者及采集量相關，增加培養體積可提高檢測靈敏度。

臍帶血；微生物污染；血培養

Analysis on microbial contamination of 6 292 umbilical cord blood units

自20世紀90年代以來，全世界臍帶血造血干細胞保存量已超過600 000份，移植量已超過30 000例，約占同種異基因造血干細胞移植的20%[1]。臍帶血在采集和處理過程中有微生物污染的風險，因此所有的移植用臍帶血都必須進行微生物檢測，包括需氧菌、厭氧菌和真菌，檢測結果陰性是臍帶血造血干細胞合格的條件之一。本研究數據來自2011～2014年所有臍帶血的微生物檢測結果，通過對比分析旨在探討臍帶血微生物污染的概率、種類，以及臍帶血收集相關因素和檢測方法對污染率的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2011～2014年本臍血庫共檢測臍帶血6 292份，對其中的陽性標本進行病原菌鑒定。臍帶血收集相關因素：生產方式、采集者、采集量、采集方式及采集完成到開始處理的時間間隔(處理前時間)；檢測方法：培養體積、延遲上機時間及培養瓶種類。

1.2 主要儀器與試劑 病原菌培養采用美國BD公司BACTEC9000系列全自動血液培養系統及配套專用需氧瓶和厭氧瓶，細菌鑒定使用美國BD公司Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏系統。

1.3 方法

1.3.1 臍帶血的采集與運送 參照《臍帶血造血干細胞庫技術規范》,胎兒娩出后，在近胎盤端對臍帶穿刺部位進行嚴格消毒，將采血針于止血鉗固定部位上端5 cm處快速刺入臍靜脈，使臍帶血通過重力作用流入一次性采血袋內，輕輕搖晃采血袋使血液和抗凝劑充分混勻。采集后由專人使用專用儲存箱保存運輸(溫度保持在4～25 ℃)，送達臍血庫后置于4 ℃冰箱存放，并保證在采集后48 h內完成處理。

1.3.2 微生物檢測 參照紐約臍血庫Rubinstein等[2]的分離方法，無菌技術抽取有核細胞分離后血漿-紅細胞懸液平均注入需氧和厭氧瓶，輕輕顛倒混勻后上機檢測，使用美國BD公司BACTEC9000系列全自動血液培養系統培養5 d，儀器通過分析培養瓶內熒光感應物質的變化進行結果判定。至少1個培養瓶陽性即判定該單位臍帶血陽性，常規工作中按廢棄處理。

1.3.3 病原菌鑒定 當血培養儀陽性報警時，觀察生長曲線并進行涂片、染色、鏡檢和培養，使用Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏系統及配套鑒定板進行鑒定。如果儀器提示陽性而鏡檢和培養未見細菌，則為假陽性。

1.3.4 不同檢測方法 (1)培養體積：2011年1月至2013年10月，常規檢測中取10 mL標本平均注入需氧和厭氧瓶，2013年11月至2014年12月將培養體積提高為20 mL，每瓶10 mL。兩種情況下檢測標本均為臍帶血分離后血漿-紅細胞懸液。(2)延遲上機時間：統計2013年11月至2014年8月所有臍帶血培養的延遲上機時間，從將血漿-紅細胞懸液注入培養瓶開始計時至放入培養儀中為止，分為12、24 h。從2014年9月開始，所有培養瓶均為注入標本后立即上機，即延遲時間為0。(3)培養瓶種類：常規檢測中使用的血培養瓶為BACTEC樹脂需氧瓶(Plus Aerobic)/BACTEC樹脂厭氧瓶(Plus Anaerobic)。從2014年9月起，在保證培養體積和上機時間相同的條件下，對采集量大于或等于90 mL的256份臍帶血同時進行了BACTEC標準需氧瓶(Standard Anaerobic/F)/BACTEC含溶血素厭氧瓶(Lytic/10 Anaerobic/F)檢測。每種組合中只要有1個培養瓶陽性即判定該單位臍帶血陽性。

1.4 統計學處理 使用SPSS17.0統計軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 微生物污染檢出率 6 292份臍帶血檢出陽性標本131份，污染率為2.1%。2011～2014年共采集臍帶血13 361份，因量少、細胞數不足、凝塊、微生物污染等廢棄7 289份，廢棄率為54.6%，其中因微生物污染廢棄131份，占總采集量的1.0%，占總廢棄量的1.8%。2011～2014年微生物污染檢出率呈逐年升高，差異有統計學意義(χ2=31.56，P<0.001),見圖1。

圖1 2011～2014年微生物污染檢出率

2.2 微生物污染病原菌 131份臍帶血中有118份為單一病原菌生長，3份為復合病原菌生長，1份鑒定為陰性，9份未得到鑒定結果，共計124株病原菌，病原菌種類共計27種。131份陽性標本病原菌鑒定結果見表1，其中大腸埃希菌和凝固酶陰性葡萄球菌最為常見，分別占23.9%和20.9%。

2.3 臍帶血收集相關因素對微生物污染率的影響 131份陽性標本中，95份來自自然分娩者，36份來自剖宮產者；75份標本由縣市級醫院采集者采集，其余56份由三級綜合醫院采集者采集；采集量低于80 mL的標本88份，80 mL及以上的標本43份；第3產程采集72份，第3產程+體外采集55份，體外采集4份；處理前時間小于12 h的標本9份，大于24 h的標本43份。自然分娩者臍帶血標本、縣市級醫院采集標本、采集量低于80 mL的標本陽性率分別高于剖宮產者臍帶血標本、三級綜合醫院采集標本和采集量大于80 mL的標本，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 陽性標本病原菌鑒定結果[n=134▼,n(%)]

*：緩癥鏈球菌3株、草綠色鏈球菌1株、無乳鏈球菌2株、中間鏈球菌2株；#：產氣腸桿菌2株、陰溝腸桿菌5株；△：糞腸球菌4株、屎腸球菌1株；▽：脆弱擬桿菌1株、普通擬桿菌1株；▲：熒光假單孢菌1株、斯氏假單孢菌1株；▼:131份臍帶血中3份為復合病原菌污染，故n=134。

表2 臍帶血收集相關因素對微生物污染率的影響

2.4 檢測方法對培養結果的影響 培養體積由10 mL提高為20 mL后，陽性檢出率升高，差異有統計學意義(χ2=39.93，P<0.001)；延遲上機時間為24 h時，陽性檢出率低于0、12 h，但差異無統計學意義(χ2=1.13，P=0.568)；使用樹脂需氧瓶/樹脂厭氧瓶進行常規檢測的743份臍帶血中陽性25份，陽性率為3.4%，同時使用標準需氧瓶/含溶血素厭氧瓶檢測的256份臍帶血，其陽性標本與常規血培養瓶檢測結果相同，見表3。

表3 檢測方法對培養結果的影響

3 討 論

臍帶血作為干細胞的來源之一已經得到廣泛認可，然而在實際工作中相當一部分臍帶血在采集后由于采集量少、細胞數不足、凝塊、微生物污染等原因被廢棄，本研究臍帶血總廢棄率高達54.6%，其中微生物污染廢棄臍帶血占總廢棄量的1.8%。由于臍帶血從開始采集到完成處理要經過很多步驟，整個過程難免受到污染，降低臍帶血微生物污染率不僅可以節約工作成本，同時在一定程度上保證了移植患者的安全。因此，必須嚴格規范采分操作并提高檢測方法的靈敏度。

隨著臍帶血相關技術的成熟，臍帶血污染率一般為3%左右，本研究為2.1%，張樂玲等[3]報道為1.8%，而Clark等[4]報道為4.0%。微生物污染率呈現升高趨勢的可能原因：(1)隨著采集范圍的擴大，許多縣市級醫院開始采集臍帶血，但采集者經驗有限，很可能會造成污染率提高；(2)檢測方法的改進提高了微生物的檢出率。Chen等[5]已研究表明，定期對采集頻率較低的采集者進行理論和實踐培訓，可有效提高采集人員的技術水平，從而降低污染率。

本研究病原菌鑒定結果顯示，大腸埃希菌和凝固酶陰性葡萄球菌最為常見，與其他報道基本一致[3-4]。自然分娩時污染率明顯高于剖宮產，這是由于產婦陰道內含有大量細菌，同時自然分娩時有羊水、胎糞污染手術臺面，胎盤和臍帶極易受到污染[6]。此時采集者應高度重視無菌操作，可考慮聯合使用消毒劑如75%乙醇和氯已定，后者作用持久，可有效彌補乙醇蒸發速度快的缺點；同時，增加對臍帶穿刺部位的消毒次數，尤其要避免反復穿刺[7]。除此之外，對于需要保存臍帶血的產婦可建議其剖腹生產。臍帶血采集者應是經過專業培訓并取得合格證的醫師或助產士，要求經驗豐富并能夠處理突發事件，然而縣市級醫院采集者的采集頻率較低、采集經驗不足，因此要加強理論知識和實踐操作的培訓和考核。當臍帶血采集量低于80 mL時陽性率明顯升高，說明采集技術是影響臍帶血污染的主要因素之一。采集技術欠佳、多次穿刺采集是造成采集時污染的主要原因，采集者應使采血針尖斜面向下并一次性完全進入血管內，針體反復進出血管會增加污染概率，切不可為增加采集量反復穿刺而忽視嚴格的消毒規程。體外采集法與體內采集法的陽性率無明顯差異，但自然分娩時，通過體內采集能夠獲得更多的有核細胞數、CD34+細胞數及集落細胞數，有利于提高庫存臍帶血的質量；而剖宮產時，采集法對臍帶血質量并無影響[8]。因此，為保證臍帶血的低污染和高質量，可引導采集人員根據生產方式選擇不同的采集方法，例如當自然分娩時可選擇體內采集法采集臍帶血。臍帶血污染率雖未升高，但隨著采集后存放時間的延長，造血干祖細胞的集落形成能力會逐漸下降，因此臍帶血采集后應盡快處理[9]。

加大培養體積會提高檢測方法的靈敏度，這一結論具有重要的指導意義。因為移植患者免疫力低下，低濃度病原菌也可能導致其死亡，同時干細胞體外擴增技術和臍帶血雙份移植技術的大力開展也對微生物的檢測方法提出了更高的要求。延遲送檢時間并不影響檢測結果，這一結論與湯瑾等[10]認為的送檢時間不會影響血培養結果一致，但孫景勇等[11]認為培養瓶在室溫放置24 h，細菌的陽性檢出率會明顯下降，結論不同可能與其研究的最長延遲時間僅為16 h有關。由于細菌會在培養瓶內生長從而引起熒光變化，當放入儀器時已不能被檢出，而且根據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)血培養推薦指南，血標本接種到培養瓶后應立即送檢，切勿冷藏，實際工作中應盡快送檢[12]。

美國BD公司BACTEC9000系列全自動血液培養系統配套的樹脂培養瓶通過吸附和離子交換作用可減少抗菌藥物對細菌生長的影響，主要適用于已接受抗菌藥物治療的患者。考慮到孕婦這一特殊群體很少使用抗菌藥物，而且溶血素配方能夠溶解紅細胞、白細胞，釋放營養物質和被吞噬的細菌，從而提高細菌檢出率。本研究結果顯示，兩種培養瓶組合在檢測256份臍帶血時的陽性檢出率相同，可考慮將樹脂需氧瓶/樹脂厭氧瓶更換為成本較低的標準需氧瓶/含溶血素厭氧瓶。

綜上所述，為提高合格臍帶血的數量和比例，臍帶血庫應加強對采集者和實驗室人員的培訓，使其熟練掌握采集技術，嚴格執行無菌操作制度。在保證母嬰安全的同時，應選擇污染風險較低的生產方式和采集方法，采集后及時處理和送檢，以降低臍帶血的污染廢棄率。

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ZhangJin，TongHaixia△，MaLiangyan，WangDianchang，DuanXiaojing

(CordBloodBankofLiaoningProvince,ShengjingHospitalofChinaMedical

University,Shenyang,Liaoning110022,China)

Objective To investigate the rate of microbial contamination and types of pathogenic bacteria during collection and processing of umbilical cord blood units,and to explore the effects of umbilical cord blood collection related factors and detection methods on culture results.Methods The plasma and red blood cell suspension specimens from 2011 to 2014 were collected and poured into aerobic culture flasks and anaerobic culture flasks.Microbial contamination was detected by using the BACTEC9000 automatic blood culture system for 5 d,and all the positive samples were separated and identified for microbial species.The effects of several factors,including mode of delivery,collectors,volume of sample,collection method,time before sample handling,volume of culture and kinds of culture flask,on microbial contamination were also discussed in this study.Results In the 6 292 units of umbilical cord blood tested,131 units were contaminated by pathogenic bacteria,and the contamination rate was 2.1%.The most common pathogenic bacteria were Escherichia coli(23.9%) and coagulase negative staphylococci(20.9%).The positive rate was increased in specimens collected from women underwent vaginal delivery,specimens collected by collectors in county(municipal) hospitals,and specimens whose blood volume was less than 80 mL;moreover,the positive rate was ascended when the culture volume increased from 10 mL to 20 mL,there was statistically significant difference(P<0.05).Conclusion Microbial contamination was associated with mode of delivery,collector and blood volume,the increase of culture volume could promote the sensitivity.

umbilical cord blood；microbial contamination；blood culture

張晉(1986-)，檢驗技師，本科，主要從事臍帶血研究。△

Tel：18940257287；E-mail：tonghx2009@163.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.025

R

A

1671-8348(2016)35-4980-03

2016-08-13

2016-10-23)