結腸癌中腫瘤相關鈣信號轉導蛋白-2的表達及其臨床意義

趙 鵬，陳俊卯，曹文斌，楊光華，虞向陽，劉春輝，鄭 陽

(華北理工大學附屬醫院普外科，河北唐山 063000)

結腸癌中腫瘤相關鈣信號轉導蛋白-2的表達及其臨床意義

趙 鵬，陳俊卯，曹文斌，楊光華，虞向陽，劉春輝，鄭 陽

(華北理工大學附屬醫院普外科，河北唐山 063000)

目的 檢測腫瘤相關鈣信號轉導蛋白-2(TROP-2)在結腸癌組織及結腸癌細胞中的表達水平，探討TROP-2與結腸癌進展的相關性及其對臨床預后的意義。方法 應用免疫組織化學法檢測TROP-2蛋白在結腸癌組織、癌旁組織及正常結腸組織中的表達情況，回顧患者的臨床資料，分析TROP-2蛋白表達水平與不同臨床病理特征的相關性及其對臨床預后的意義。應用蛋白質印跡法檢測TROP-2蛋白在新鮮結腸癌組織標本中的表達情況，并應用免疫熒光法觀察TROP-2蛋白的定位。結果TROP-2蛋白主要定位于腫瘤細胞的細胞膜，在細胞質、細胞核則少量表達或不表達。結腸癌組織中TROP-2蛋白表達水平高于癌旁組織和正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)；結腸癌組織中TROP-2蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度無相關性(P>0.05)，而與淋巴結轉移情況及Dukes分期有明顯相關性(P<0.05)；伴淋巴結轉移的患者結腸癌組織TROP-2蛋白陽性率高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著腫瘤Dukes分期的進展，結腸癌組織中TROP-2表達水平逐漸升高；TROP-2 蛋白的高表達是結腸癌患者不良預后的獨立因子。結論 結腸癌中存在TROP-2的高表達，其在結腸癌侵襲和轉移過程中可能發揮著重要作用。

結腸腫瘤；腫瘤相關鈣信號轉導蛋白-2；侵襲；遷移

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來發病率逐年上升，且總體5年生存率仍然較低。腫瘤的侵襲和轉移是導致患者死亡的主要原因，目前對于結腸癌侵襲和轉移機制的研究成為熱點，但確切的機制尚不明確。腫瘤相關鈣信號轉導蛋白-2(tumor-associated calcium signal transducer-2，TROP-2)是一種跨膜糖蛋白，最早發現于人滋養層細胞[1]，也稱為人滋養層細胞表面抗原-2，它主要參與細胞內鈣離子水平的調控。近年來發現，TROP-2在多種人類上皮源性腫瘤中存在高表達，而其在正常組織中不表達或低表達，TROP-2被認為是一種腫瘤相關抗原，與腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關。然而，目前國內外對于結腸癌中TROP-2表達情況的研究較少。本實驗采用蛋白質印跡法(Western blotting)、免疫組織化學法和免疫熒光法檢測結腸癌手術切除標本中TROP-2蛋白的表達情況，并結合患者的臨床病理資料進行分析，旨在探討結腸癌中TROP-2的表達與其進展的相關性，并進一步探討其臨床意義，為結腸癌的早期診斷治療和預后評價提供理論依據和參考指標，為選擇結腸癌靶向治療的新靶點提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 用于Western blotting檢測的新鮮結腸癌手術切除組織標本共47份，均取自華北理工大學附屬醫院術后病理確診為原發性結腸腺癌的患者，所有患者均具有完整的臨床病理資料，術前均未接受放、化療等輔助治療。其中，無淋巴結轉移20例，有淋巴結轉移27例；根據國際Dukes分期標準：A期6例、B期14例、C期20例、D期7例。

用于免疫組織化學及免疫熒光染色的結腸癌組織切片來源于華北理工大學附屬醫院病理科存檔的結腸癌組織蠟塊，所選病例共82例，且選取的病例術前均未接受放、化療等輔助治療，術后病理診斷均為原發性結腸腺癌。其中，女30例，男52例；年齡35～90歲，平均(61.6±9.8)歲；低分化腺癌25例、高分化腺癌24例、中分化腺癌33例；無淋巴結轉移40例，伴有淋巴結轉移42例；根據國際Dukes分期標準：A期10例、B期28例、C期26例、D期18例。本組病例中7例失訪，75例有完整的隨訪信息，生存時間為病理確診到死亡或最后1次隨訪的時間。

1.2 主要試劑 鼠抗人TROP-2單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗兔熒光二抗(lgG-DyLight 488)、細胞核染料碘化丙啶(PI)購自美國Cell Signaling Technology公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白濃度測定試劑盒、牛血清清蛋白(BSA)及超敏電化學發光(ECL)試劑盒購自碧云天生物技術研究所。免疫組織化學檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測結腸癌組織切片中TROP-2蛋白的表達 免疫組織化學染色步驟采用SP法，以鼠抗人TROP-2抗體為一抗，以自身對照作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。 由本院病理科兩名醫師參照文獻[2]各自獨立完成免疫組織化學結果的判定和評分。腫瘤細胞質及細胞膜中出現棕黃色顆粒記為陽性細胞，在高倍鏡下任選5個視野進行觀察，根據陽性腫瘤細胞所占百分率記分，無明顯陽性染色細胞記為0分，陽性細胞數占1%～10%記為1分，陽性細胞數大于10%～50%記為2分，陽性細胞數大于50%記為3分；染色強度按腫瘤細胞著色的深淺計分：無著色記為0分；黃色為弱陽性，記為1分；淺棕色為中等陽性，記為2分；棕褐色為強陽性，記為3分；每份標本TROP-2染色的總分為兩項之積：0分為(-)，1～3分為(+)，4～6分為(++)，7～9分為(+++)，總分4分以上記為高表達。

1.3.2 間接免疫熒光法檢測結腸癌組織切片中TROP-2的表達及定位 切片常規脫蠟及脫水，滴加3%過氧化氫(H2O2)，抗原修復后加入一抗(鼠抗人TROP-2抗體)和熒光素Alexa Fluor?488標記的熒光二抗，細胞核以PI染色，FV1000激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察并拍片。

1.3.3 Western blotting檢測結腸癌組織標本和細胞中TROP-2蛋白的表達 提取組織標本的總蛋白，蛋白質定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣量為100 μg蛋白，電泳并轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，抗TROP-2一抗4 ℃孵育過夜。Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)漂洗3次，二抗室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色。以β-actin為內參。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，計數資料以例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗進行生存分析，獨立因素分析采用Logistic回歸分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學檢測結腸癌組織中TROP-2蛋白的表達 82例結腸癌組織中TROP-2蛋白陽性表達者75例(91.5%)，其中高表達55例(67.1%)，低表達20例(24.4%)；癌旁組織中TROP-2蛋白陽性表達者10例(12.2%)，高表達2例(2.4%)，低表達8例(9.8%)。如圖1所示，TROP-2的陽性染色顆粒呈棕色或深棕色顆粒，主要分布在腫瘤細胞的細胞膜和細胞質中,呈彌散分布，胞核陰性。切緣正常結腸組織中無TROP-2陽性染色顆粒。結腸癌組織中TROP-2蛋白的表達強度高于癌旁組織和正常組織。結腸癌組織TROP-2的陽性率高于癌旁組織和正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)。隨著腫瘤Dukes分期的進展，腫瘤組織中TROP-2的表達強度亦逐漸增強，見圖2。

A：正常組織；B癌旁組織；C：癌組織。

圖1 結腸癌組織TROP-2蛋白的表達(免疫組織化學法，×200)

2.2 結腸癌組織中TROP-2的表達與各臨床病理參數的關系 結腸癌組織中TROP-2蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度無相關性(P>0.05)，而與淋巴結轉移情況及腫瘤Dukes分期有明顯相關性。伴淋巴結轉移的患者結腸癌組織TROP-2蛋白陽性率高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著腫瘤Dukes分期的進展， TROP-2蛋白陽性率逐漸升高，C+D期患者TROP-2蛋白陽性率高于A+B期者，差異有統計學意義(P<0.05)。結腸癌組織中TROP-2蛋白的表達與各臨床病理參數的關系，見表1。

2.3 CLSM觀察結腸癌組織中TROP-2的免疫熒光染色 本實驗以雙標法分別標記TROP-2蛋白和細胞核，熒光素Alexa Fluor?488(綠色熒光)偶聯的山羊抗小鼠二抗，特異性結合一抗鼠抗人TROP-2單克隆抗體，PI標記細胞核(紅色熒光)。CLSM下觀察熒光，如圖3所示，TROP-2呈環形綠色熒光，主要是腫瘤細胞膜表達，細胞核呈紅色，TROP-2在細胞質、細胞核則少量表達或不表達。正常結腸組織基本無TROP-2蛋白的綠色熒光表達，提示TROP-2在正常結腸組織中基本無表達。隨著Dukes分期的進展，TROP-2的綠色熒光呈逐漸增多的趨勢，提示隨著腫瘤Dukes分期的進展，TROP-2的表達量逐漸升高。

A：Dukes A期；B：Dukes B期；C：Dukes C期；D：Dukes D期。

圖2 不同臨床Dukes分期結腸癌組織TROP-2蛋白的表達(免疫組織化學法，×200)

2.4 Western blotting檢測結腸癌組織中TROP-2蛋白的表達 如圖4所示，正常結腸組織、癌旁組織及結腸癌組織中均有TROP-2蛋白的表達，結腸癌組織中TROP-2蛋白表達水平高于癌旁組織和切緣正常結腸組織，差異有統計學意義(P<0.01)；癌旁組織TROP-2表達水平高于切緣正常結腸組織，但差異無統計學意義(P>0.05)。如圖5所示，伴淋巴結轉移的結腸癌組織TROP-2表達水平高于無淋巴轉移的結腸癌組織，差異有統計學意義(P<0.01)；如圖6所示，隨著腫瘤Dukes分期的進展，結腸癌組織中TROP-2表達水平逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 結腸癌中TROP-2的表達與預后的相關性 TROP-2高表達結腸癌患者總體生存時間為(31.65±10.14)個月，低表達患者總體生存時間為(64.42±6.45)個月。如圖7所示，TROP-2高表達患者的5年生存率明顯低于TROP-2低表達患者(38.2%vs. 63.6%)，差異有統計學意義(χ2=34.520，P=0.005)。單因素生存分析結果顯示，TROP-2高表達(RR=6.43，95%CI：2.17～9.62，P<0.001)、淋巴結轉移(RR=10.94，95%CI：7.43～12.96，P<0.001)、腫瘤Dukes分期(RR=7.58，95%CI：4.26～10.71，P<0.001)與術后的不良預后相關；多因素回歸分析表明，校正性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結轉移等影響因素后，TROP-2蛋白高表達(RR=17.209，95%CI：4.239～69.857，P<0.001)是結腸癌患者不良預后的獨立因子。

圖3 結腸癌組織與正常結腸組織TROP-2蛋白的表達與定位(CLSM×1 200)

1：結腸癌組織；2：正常結腸組織；3：癌旁組織。

圖4 結腸癌組織、癌旁組織及正常結腸組織TROP-2蛋白的表達

1、2：無淋巴轉移的結腸癌組織；3、4：伴淋巴結轉移的結腸癌組織。

圖5 TROP-2蛋白表達與淋巴轉移的相關性

圖6 不同臨床Dukes分期結腸癌組織TROP-2蛋白的表達

圖7 TROP-2蛋白表達相關結腸癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

結腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，盡管治療方法有了很大的進步，但總體病死率仍然很高。腫瘤的侵襲和轉移是導致患者死亡的主要原因之一。統計表明約50%的結腸癌患者雖然接受了有效的治療，但最終仍死于腫瘤的侵襲與轉移。國內外針對結腸癌侵襲和轉移機制的研究較多，但其確切的機制仍不完全清楚。

TROP-2是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于TACSTD基因家族，由323個氨基酸所組成，包括信號肽、胞外區、跨膜區和胞質尾區4個部分。最初認為TROP-2主要參與細胞內鈣離子水平的調控，能夠改變細胞內的鈣離子水平[3-4]。近年來發現，多種人類上皮源性腫瘤(如卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等)中均存在TROP-2蛋白的高表達[5-13]，其在正常組織中不表達或低表達，TROP-2也被認為是一種腫瘤相關抗原，目前國內對結腸癌中TROP-2表達情況及其作用的研究較少。

本研究發現，TROP-2蛋白主要定位于結腸癌細胞的細胞膜上，結腸癌組織中TROP-2蛋白表達水平高于癌旁組織和正常結腸組織；結腸癌中TROP-2蛋白表達水平與腫瘤的淋巴結轉移、臨床Dukes分期有明顯相關性，而與患者年齡、性別、腫瘤分化程度無相關性。隨著Dukes分期的進展，結腸癌組織中TROP-2表達水平逐漸升高。本研究還發現，TROP-2高表達患者總生存率低于TROP-2低表達患者。

綜上所述，TROP-2在結腸癌的進展過程中可能起著重要作用，TROP-2蛋白有望成為結腸癌分子靶向治療的新靶點，但結腸癌中TROP-2蛋白高表達的具體機制仍有待進一步研究。

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The expression and clinical significance of TROP-2 protein in colon cancer

ZhaoPeng，ChenJunmao，CaoWenbin，YangGuanghua，YuXiangyang，LiuChunhui，ZhengYang

(DepartmentofGeneralSurgery,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To detect the expression of TROP-2 protein in colon cancer tissues and cell line,and to explore the relationship between TROP-2 protein and the prognosis of colon cancer and its clinical significance．Methods Immunohistochemical staining method was used to detect the expression of TROP-2 protein in colon cancer tissues,tumor-adjacent tissues and normal colon tissues.By reviewing the clinical data of patients,the correlation between the expression level of TROP-2 and clinical pathological features and significance of TROP-2 for clinical prognosis we analyzed.The expression of TROP-2 protein in fresh tissue specimens was detected by using Western blotting method.Furthermore,the immunofluorescence staining was applied to observe the localization of TROP-2 protein.Results The TROP-2 protein mainly located on tumor cell membrane,while little or no TROP-2 protein expressed in the cytoplasm and nucleus.The expression level of TROP-2 in colon cancer tissues was significantly higher than that in tumor-adjacent tissues and normal tissues,there was statistically significant difference(P<0.01).No correlation was found between the expression of TROP-2 and sex,age and degree of tumor differentiation(P>0.05),while the expression of TROP-2 was significantly correlated with lymph node metastasis and Dukes stage(P<0.05).The positive rate of TROP-2 protein expression in colon cancer tissues with lymph node metastasis was obviously higher than those without lymphatic metastasis(P<0.05).With the progress of the Dukes stage,the expression level of TROP-2 protein also increased gradually.TROP-2 protein up-regulation maybe identified as an independent predictive factor for poor prognosis.Conclusion Increased expression of TROP-2 is observed in colon cancer tissues.TROP-2 may play an important role in colon cancer metastasis and invasion,and could be used as an independent predictive factor for poor prognosis.

colonic neoplasms；tumor-associated calcium signal transducer-2；invasion；migration

趙鵬(1977-)，副主任醫師，博士，主要從事胃腸道腫瘤研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.020

R

A

1671-8348(2016)35-4963-04

2016-06-26

2016-10-03)