尖端放電噴霧電離質譜技術鑒定肺癌的差異性磷脂研究

溫 華，魏益平，張興磊，朱騰高，陳立如，徐建軍△

(1.南昌大學第二附屬醫院心胸外科,南昌 330006；2.東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室,南昌330013)

尖端放電噴霧電離質譜技術鑒定肺癌的差異性磷脂研究

溫 華1，魏益平1，張興磊2，朱騰高2，陳立如1，徐建軍1△

(1.南昌大學第二附屬醫院心胸外科,南昌 330006；2.東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室,南昌330013)

目的 運用尖端放電噴霧電離質譜技術鑒定肺癌差異性磷脂。方法 在不對肺組織進行任何預處理的前提下，采用自制的甲醇萃取輔助的尖端放電噴霧離子源對14例肺癌患者的肺癌組織和癌旁組織的差異性磷脂[質荷比(m/z)756.7]及標準品[二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)+Na+]進行多級質譜檢測，萃取劑甲醇的流速為4μL/min，設置離子源為正離子模式，一級質譜掃描范圍為m/z750～850，多級譜圖掃描范圍為m/z200～800，離子傳輸管溫度150 ℃，噴霧電壓3.5kV，透鏡電壓65.0V，選定離子的隔離寬度為1.6Da，碰撞能量為13%。結果m/z756.7的多級質譜圖與標準品[DPPC+Na+]完全相符，即肺癌的差異性物質為DPPC。結論 尖端放電噴霧電離質譜技術利用多級質譜分析可以很好地對肺癌和癌旁組織的差異性磷脂進行定性，DPPC可能成為新的肺癌分子標志物，為肺癌的診斷提供新的方法。

肺腫瘤；二棕櫚酰磷脂酰膽堿；尖端放電質譜分析；鑒定

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一[1]，極大地危害了人們的生命健康。由于對肺癌的發病機制尚不清楚，因而缺乏針對性治療手段，外科手術仍是目前治療肺癌最直接、有效的方法，臨床研究表明，早期診斷是改善肺癌預后的關鍵[2-4]。目前仍以影像學檢查為診斷肺癌的主要手段，患者確診時往往已發展為肺癌中晚期；同時影像學檢查無法反映肺癌的發病機制，不能為治療及藥物開發提供靶點。因此，對肺癌患者發病機制及生物標志物的研究有利于其早期診斷，具有非常重要的臨床價值。

質譜分析是通過檢測待測物離子的特異質荷比來分析被測物質的分析方法，具有靈敏度高、特異性好、檢測方式靈活多樣等優點[5]。2004年有學者提出了在無需樣品預處理的條件下直接分析固體表面痕量待測物的電噴霧解吸電離技術[6]，隨即掀起了直接離子化技術的研究熱潮。近幾年來，質譜技術不斷地被應用于腎結石、前列腺癌等疾病的檢測及診斷[7-8]。尖端放電噴霧電離質譜分析是基于紙噴霧電離質譜技術原理發展的一種基于樣品中分子組成或含量的不同而實現樣品檢測的一種對復雜樣品中不同類型化合物的快速分析檢測方法[9]，可在無需樣品預處理的情況下對各種臨床組織樣品進行分析[10]。多級質譜分析是對目標母離子進行多級碰撞誘導解離實驗，通過施加能量使其運動加劇，并按照分子結構的本質規律進行裂解，從而獲得具有分子結構特征的碎片離子，獲得相關的串聯質譜譜圖，總結其裂解規律、推導出其分子結構式[11-13]。本研究采用自制的甲醇萃取輔助的針尖電噴霧離子源，在無需復雜樣品預處理的情況下檢測肺癌組織及癌旁組織，運用多級質譜分析方法鑒定肺癌差異性磷脂的效果及應用。

1 資料與方法

1.1 組織來源 本研究經南昌大學第二附屬醫院臨床委員會批準，所有患者知情同意。 病例入選標準：2013年1～10月入院的肺癌患者；術前未經化學治療等藥物干預，術中留取肺癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣5 cm以上，視為正常肺組織)標本，所留取樣品置于-80 ℃保存。入選患者14例，手術后病理診斷均為非小細胞肺癌，其中男10例，女4例，年齡40～71歲，腺癌7例，鱗癌7例。

1.2 儀器與試劑 甲醇萃取輔助的針尖電噴霧離子源(自制)；LTQ-XL增強型線性離子阱質譜儀，配有Xcalibur數據處理系統(美國Finnigan公司)；KQ3200型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。標準品二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，分析純，美國Sigma-Aldrich公司)；5%碳酸氫鈉注射液(羅欣醫藥集團有限公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；實驗用水為2次去離子水。

1.3 方法 離子源(自制)由兩部分構成，即尖端刺有微量組織樣品的針灸針(0.35 mm×75 mm)和樣品上方的萃取劑甲醇，電噴霧電壓連接于針灸針針柄上，樣品與萃取劑及質譜入口的距離均約5 mm；組織樣品未經任何處理，解凍后取大小約1 mm3的組織用于質譜分析。設置離子源為正離子模式，一級譜圖掃描范圍為質荷比(m/z)750～850，多級譜圖掃描范圍m/z 200～800,離子傳輸管溫度150 ℃，噴霧電壓3.5 kV，透鏡電壓65.0 V，選定離子的隔離寬度為1.6 Da，碰撞能量為13%，其他條件系統自動優化。根據前期得到的主成分分析(PCA)結果[14]及此次的PCA結果，選定具有差異性的物質m/z 756.7為母離子進行多級質譜分析，通過對比該物質的標準品的多級質譜圖，從而達到定性。

2 結 果

2.1 m/z 757的多級質譜圖 按擬定實驗方法對14例肺癌患者的癌組織和癌旁組織共計28份組織樣品進行質譜檢測，在一級譜圖發現了質子化的卵磷脂(m/z 756.7)，見圖1；其二級質譜中存在特征離子m/z 698、m/z 574等，見圖2，符合文獻[15]上卵磷脂的裂解規律，表明該物質為卵磷脂；其三級質譜中存在特征離子m/z 574、m/z 552等。依據其丟失的相對分子質量、碎裂規律及相關文獻[16]上報道的DPPC是肺表面活性物質最主要的脂質成分，在維持肺組織正常結構及功能起著重要作用，作者推導m/z 756.7為DPPC與一個鈉離子的結合物。

A：肺癌組織一級質譜圖；B：癌旁組織一級質譜圖。

圖1 肺組織一級質譜圖

圖2 m/z 756.7的多級質譜圖

2.2 m/z 757的定性鑒定 與標準品DPPC配置的鈉鹽溶液的多級質譜譜圖(圖3)比較，m/z 756.7的二級譜圖、三級譜圖與標準品[DPPC+Na+]完全符合，表明m/z 756.7為物質[DPPC+Na+]；質譜分析能夠較好地對未知物質進行定性分析。

圖3 標準品[DPPC+Na+]的多級質譜圖

3 討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率及病死率高居榜首，其肺部表現可出現呼吸困難、咳嗽、肺不張、喘鳴、肺部炎癥等。目前對肺癌的發病機制仍不清楚，缺乏針對性的藥物。尖端放電噴霧電離質譜技術是近年來發展起來的直接質譜分析方法，可在無需復雜樣品預處理的情況下對臨床組織、血液等機體復雜的樣品進行快速分析，一般在數秒內即可獲得樣品的質譜信息。碰撞誘導解離(collision induced dissociation，CID)在質譜中用來證明帶電物質[M+H]+的特定分子式和檢測其碎片離子[17]；有研究應用多級質譜分析方法對煙草中的煙堿進行多級碰撞誘導解離實驗，得到了煙堿的特征碎片離子[11]。由此可見，尖端放電噴霧電離質譜技術多級質譜分析可用于物質的定性分析，在發現肺癌生物標記物的定性中具有重要價值。

本研究結果顯示：在正離子模式下，通過多級質譜檢測能對癌旁組織中高于肺癌組織的差異性磷脂m/z 756.7定性分析，確定其為[DPPC+Na+]。DPPC是肺表面活性物質(pulmonary srfactant，PS)最主要的脂質成分，PS的主要成分為磷脂含量高達90%，在肺泡Ⅱ型上皮細胞的粗面內質網合成，通過高爾基體運送到泡體，最后在分泌前被板層小體包裹，板層小體通過細胞外分泌作用，使PS分泌到肺泡表面，形成復雜的格子樣排列，叫管狀髓磷脂(管鞘)，使肺泡表面氣液間形成單分子層。PS具有參與宿主防御及免疫調節等功能，維持肺的穩定及抗炎作用[16]。肺癌患者中的腫瘤壞死因子顯著增多[18]，腫瘤壞死因子可能使表面活性物質的合成酶降解，導致表面活性物質合成降低，引起肺不張、肺部炎癥等；即肺癌組織中的DPPC含量低于癌旁組織。有研究報導，肺泡干細胞可以分化成肺泡Ⅰ型上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞，均與肺癌的發生有重要的關系[19]；損傷的肺泡Ⅰ型上皮細胞產生信號1替代EGFR-KRAS激活肺泡Ⅱ型上皮細胞自我修復的功能，而另一種重組的肺泡Ⅰ型上皮細胞產生信號2活化EGFR-KRAS激活肺泡Ⅱ型上皮細胞的癌變，形成類似肺泡Ⅱ型上皮細胞的腫瘤；與本研究的結果相符。

綜上所述，本研究利用了尖端放電噴霧電離質譜技術實現了對肺癌差異性磷脂的鑒定，可能成為新的肺癌分子標志物。但本研究中的DPPC還需要進一步確定其在肺癌的發生、發展過程中不同時期及癌旁組織中的含量，這可為肺癌的診斷及臨床分期提供新的方法。

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Identification of differential phospholipids in lung cancer by tip-spray ionization mass spectrometry*

WenHua1,WeiYiping1,ZhangXinglei2,ZhuTenggao2,ChenLiru1,XuJianjun1△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China;2.JiangxiKeyLaboratoryofMassSpectrometry,DonghuaUniversityofScience&Technology,Nanchang,Jiangxi330013,China)

Objective To identify the differential phospholipid in lung cancer by using tip-spray ionization mass spectrometry(TSI-MS).Methods Under the premise of no pretreatment of lung tissues,the differential phospholipid m/z 756.7 in lung carcinoma tissues and adjacent normal tissues of 14 cases of patients with lung cancer and the standard [DPPC+Na+] were detected by multistage mass spectrometry using a self-made methanol extraction assisted tip discharge ionization source.The flow rate of methanol was 4 uL/min,the ion source was positive ion mode,the the scanning range of single-stage mass spectrometry was m/z 750-850,the scanning range of multistage mass spectrometry was m/z 200-800,the ion transport tube temperature was 150 ℃,the spray voltage was 3.5 kV,the lens voltage was 65 V,the selected ion isolation width was 1.6 Da,and the collision energy was 13%.Results The mass spectrum of m/ z 756.7 detected by multistage mass spectrometry was consistent with the standard [DPPC+Na+],that was,DPPC was the differential material of lung cancer.Conclusion TSI-MS can be used to characterize the differential phospholipids in lung cancer tissues and adjacent tissues,DPPC may become a new molecular marker of lung cancer,providing a new method for the diagnosis of lung cancer.

lung neoplasms；DPPC；tip-spray mass spectrometry；identification

國家重大科學儀器設備開發專項基金資助項目(2011YQ170067)；國家自然科學基金資助項目(81160293，21365001)；2013年江西省研究生創新專項資金項目(YC2013-S005)。 作者簡介：溫華(1989-)，住院醫師，碩士，主要從事肺癌的臨床基礎研究。△

Tel：13907913526；E-mail：942091371@qq.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.010

R

A

1671-8348(2016)35-4929-03

2016-07-22

2016-09-17)