胃癌循環腫瘤細胞動物模型的構建

周 洲，賴 兵，高采平，王 璞，王 晗，李良平

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院消化內科，成都 610072；2.地奧九泓制藥廠前沿生物技術研究室，成都 610041)

胃癌循環腫瘤細胞動物模型的構建

周 洲1，賴 兵2，高采平1，王 璞1，王 晗1，李良平1

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院消化內科，成都 610072；2.地奧九泓制藥廠前沿生物技術研究室，成都 610041)

目的 構建胃癌循環腫瘤細胞(CTC)動物模型，為CTC運用于臨床提供依據。方法 構建4種裸鼠胃癌腫瘤模型，分別為皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤，檢測各組腫瘤生長、轉移水平，比較各組循環血中CTC數目，并進一步行單細胞實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-QPCR)分析轉移相關基因在CTC與原細胞中的表達變化，免疫組織化學法檢測腫瘤組織中血管的生成情況。結果 胃癌細胞原位移植模型是研究胃癌CTC的理想模型，裸鼠死亡率低，腫瘤轉移明顯，CTC數量較其他造模方法明顯升高。結論 成功構建了CTC裸鼠模型，為CTC應用于臨床奠定了基礎。

胃腫瘤；循環腫瘤細胞；腫瘤復發；腫瘤轉移

胃癌是最常見的嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，全世界范圍內每年約有100萬的新發病例及50萬的死亡病例[1]。在惡性腫瘤中，腫瘤轉移是重要的預后因素，是導致病死的主要原因[2]。目前，腫瘤的發現和診斷臨床上仍依賴于影像學檢查及傳統腫瘤標志的監測，難以早期發現腫瘤的轉移或復發，也難以及時反映療效。選擇最佳的治療策略，有效地限制轉移復發依然是目前臨床上的主要挑戰。循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)是指因自發或診療操作由原發灶或轉移灶進入外周血循環的腫瘤細胞。侵入循環系統的腫瘤細胞，大部分由于機體的免疫識別、機械殺傷及自身凋亡在短期內死亡，只有極少數存活下來，在適于自身存活和增殖的器官或組織形成轉移灶。而有些早期播散的腫瘤細胞或微小轉移灶在切除原發灶后可以保持休眠狀態并在若干年后形成轉移灶[3]。因此，在外周血中檢測到CTC對解決復發轉移監測、腫瘤細胞分子特征等臨床問題有重要的應用價值。動物模型能夠模擬腫瘤在體內環境的生物學行為，在腫瘤的研究中有重要作用。目前文獻報道的胃癌造模方式主要有皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤4種[4]，但是這4種方式形成的CTC少見報道。本實驗檢測各組腫瘤生長、轉移水平，比較各組CTC數目，并進一步行單細胞實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-QPCR)分析轉移相關基因在CTC與原細胞中的表達變化，免疫組織化學法了解腫瘤組織中血管生成情況，為進一步臨床監控胃癌轉移提供良好的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用的BALB/c裸鼠均為雌性，4～6周齡，體質量17～20 g，購自四川省醫學科學院實驗動物研究所，全程飼養于無特定病原體(SPF)級動物實驗房空氣層流架內(室溫恒定于20～22 ℃，空氣濕度30%～50%)，予以動物的飼料為60鈷輻射滅菌過的小鼠專用顆粒飼料，約每2～3天更換清潔籠子。本實驗動物的使用嚴格遵守實驗動物管理條例，實驗設計符合四川省實驗動物倫理委員會要求。

1.2 儀器與試劑 分離CTC的免疫磁珠為CELLection Epithelial Enrich(美國Invitrogen公司)；單細胞mRNA反轉錄試劑盒為Single Cell-to-CT qRT-PCR Kit(美國Ambion公司)；QPCR試劑盒為SsoAdvanced SYBR Green Supermix(美國Bio-Rad公司)；RPMI1640培養基，胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)及胎牛血清(美國Life Technologies公司)；免疫組織化學試劑盒及兔抗人CD34 單克隆抗體(北京中杉金橋公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗細胞的培養 SGC-7901胃癌細胞購自中國科學院上海細胞庫，培養于RPMI1640+10%胎牛血清培養液中，置于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)培養箱內通氣培養，隔天換液。

1.3.2 動物模型的構建

1.3.2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的構建 取處于對數生長期的細胞制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×108/mL。用注射器在每只裸鼠右側肩胛部皮下注射細胞懸液0.1 mL，注射后輕壓5 s。每組10只裸鼠。將裸鼠重新放回籠中觀察約1周，右側肩胛部皮下出現米粒大小質硬結節為模型建立成功。

1.3.2.2 裸鼠原位瘤模型的構建 取處于對數生長期的細胞制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×108/mL。用注射器在每只裸鼠右側肩胛部皮下注射細胞懸液0.1 mL，注射后輕壓5 s。將裸鼠重新放回籠中觀察，右側肩胛部皮下出現米粒大小質硬結節為模型建立成功。2周后，以頸椎脫臼法處死，小心剝取移植瘤，在培養液中分割成1 mm×1 mm的組織碎塊。接下來用裸鼠建立原位胃癌移植模型(10只)。用濃度為2.5%異氟烷誘導麻醉，待小鼠痛覺消失后，用手術剪在小鼠左上腹部做一約1 cm的橫切口，暴露腹腔組織，小心分離將胃暴露出腹腔，用生物膠將1塊胃癌組織粘在小鼠胃組織上。然后用6.0不可吸收外科縫線關閉腹腔。整個操作過程在超凈工作臺中完成。之后每天觀察小鼠狀態，測量小鼠體質量。

1.3.2.3 小鼠腹腔注射腫瘤細胞模型組 待SGC-7901細胞進入對數生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS液洗滌后，調節成相應的細胞濃度為5×107/mL的細胞懸液。于每只裸鼠左下腹進針，回抽無血腹腔注入0.2 mL細胞懸液。

1.3.2.4 小鼠尾靜脈注射腫瘤細胞模型組 將處于對數生長期的SGC-7901細胞濃度調整至5×107/mL,取0.1 mL細胞尾靜脈注射入裸鼠，觀察小鼠生長活動狀況。

1.3.3 血標本采集 嚴格消毒后，應用真空采血針采集眼眶靜脈血2 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，并在采集后的2 h內富集CTC。

1.3.4 免疫磁珠法篩選CTC 將250 μL免疫磁珠加入2 mL全血中，在2～8 °C溫度中輕柔旋轉，孵育30 min，然后將管子在磁場中放置2 min后輕柔地倒出上清液。將管子從磁場中移除，加入5 mL 緩沖液1(Buffer 1)，混懸均勻2～3次后繼續將試管放入磁場中2 min。再次將試管置于磁場中，移除上清液，將管子從磁場中移除，加入5 mL Buffer 1，混懸均勻2～3次后繼續將試管放入磁場中2 min。最后加入200 μL緩沖液3(Buffer 3)，將細胞充分混懸均勻后復熱至37 ℃。加入4 μL Release Buffer，在室溫中孵育15 min，同時輕柔混勻液體，然后用100～200 μL吸液管將液體充分混懸均勻5～10次。將試管放入磁場中2 min，然后將上清液移入新的試管中進行單細胞挑選。

1.3.5 循環腫瘤細胞的判定標準及挑取 將富集的細胞液在顯微鏡下再次進行形態學篩選。顯微操作平臺：Leica DM IL LED熒光顯微鏡搭配Eppendorf TransferMan NK 2顯微操作儀。篩選標準：(1)細胞呈圓形、橢圓形或長形，長徑大于10 μm；(2)光鏡下可見完整細胞形態及細胞核；(3)核質比失常。將選定的CTC在單細胞挑取臺上細針挑取收集。

1.3.6 單細胞RT-QPCR 將選取的細胞加入按說明配好的10 μL單細胞溶解液Ⅰ，室溫下孵育5 min，然后加入1 μL終止液(總體積約11 μL)，室溫孵育2 min后加入4.5 μL RT Mix(總體積約15 μL)，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min。將得到的逆轉錄cDNA均分為每份2 μL，分別加入0.6 μL Single Cell PreAmp Mix，和0.8 μL 按說明稀釋好的引物，95 ℃孵育10 min后95 ℃ 15 s，60 ℃ 4 min，進行14個循環后取1 μL預擴增產物稀釋后用于PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，6 ℃退火30 s，60個循環。RT-PCR結果以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參照計算基因mRNA相對表達水平。每次反應均設立3個復孔。

1.3.7 小鼠胃癌組織免疫組織化學 采用免疫組織化學SP染色法，常規脫蠟、水化，以0.01 mol/L檸檬酸高壓修復5 min，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育5～10 min，正常山羊血清封閉10 min后，滴加一抗，孵育過夜，其余步驟嚴格遵照即用型SP免疫組織化學試劑盒說明書進行，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。 陽性對照由試劑公司提供，用PBS代替一抗作為陰性對照。以細胞膜/細胞質/細胞核中出現明顯的黃色或黃褐色顆粒視為免疫組織化學染色陽性，綜合染色強度及陽性細胞數量進行半定量分析。

2 結 果

2.1 4組CTC數目比較 4組小鼠均接種成功，在觀察期間，皮下組的死亡率為0，原位組為30%，腹腔組為20%，尾靜脈組為50%。分別在接種成功后2、3、4周采集裸鼠眼眶靜脈血(第2周處死2只，第3周處死2只，第4周處死6只)，計數外周血中CTC數目。結果顯示，皮下組在整個實驗過程中未發生血中轉移，原位組隨著時間推移循環血中CTC數目逐漸增加，并且裸鼠死亡率低，是一種可行的構建CTC動物模型的方法，見圖1。腹腔組雖然發生轉移，但實驗過程中，CTC數目較少。尾靜脈組雖然CTC數目較腹腔組高，但裸鼠死亡率高，可能與操作技術復雜，裸鼠對尾靜脈注射耐受力低有關。

圖1 CTC計數比較

2.2 4種接種方法轉移情況比較 為了進一步闡明4種造模方式轉移情況的比較，對裸鼠轉移部位進行分析。由于腫瘤的迅速增殖，小鼠出現明顯的惡病質表現(消瘦、精神萎靡不振、食欲下降、腹水)，小鼠處死后剖腹觀察。4組裸鼠移植瘤在體內的轉移情況，見圖2。皮下組未發生任何轉移，原位組發現了肝臟(80%)、肺臟(30%)、腸系膜(100%)轉移，并且出現了腹水(40%)，腹腔組腸系膜轉移率高(100%)，腹水(80%)出現率高，但肝臟(40%)、肺臟(10%)轉移率低。尾靜脈注射組發生轉移率較原位組、腹腔組均低(肝臟轉移30%、肺臟轉移10%、腸系膜轉移50%、腹水20%)。可能與裸鼠生存期短，在實驗過程中死亡率高相關。

圖2 裸鼠模型轉移部位的比較

2.3 單細胞RT-QPCR檢測原位組CTC及SGC7901細胞中轉移相關基因表達差異 由于原位腫瘤移植裸鼠組動物死亡率低，轉移率高，是一種較好的反映腫瘤轉移的動物模型。采用免疫磁珠法提取原位組外周血中CTC行單細胞RT-QPCR，與接種細胞SGC7901行轉移相關基因表達變化比較。結果表明，基質金屬蛋白酶2(MMP2)mRNA在SGC7901細胞表達水平為(0.038±0.007)，在CTC表達水平為(0.077±0.009)，差異有統計學意義(t=6.27，P<0.05)；血管內皮生長因子(VEGF)mRNA在SGC7901細胞的表達水平為(0.027±0.013)，在CTC的表達水平為(0.082±0.002)，差異有統計學意義(t=4.52，P<0.05)；鈣粘素E(E-cadherin)mRNA在SGC7901細胞的表達水平為(0.075±0.005)，在CTC的表達水平為(0.023±0.009)，差異有統計學意義(t=8.10，P<0.05)，見圖3。

A：CELLectionTM富集CTC；B：單細胞挑取CTC；C：CTC與SGC7901細胞代謝相關基因比較；*：P<0.05,與CTC中表達水平比較。

圖3 單細胞RT-QPCR

2.4 免疫組織化學檢測原位瘤與皮下瘤中血管數目改變 采用內皮細胞特異性CD34染色和微血管計數檢測皮下移植瘤與原位胃癌血管生長水平。皮下移植瘤組血管數量明顯低于原位移植腫瘤[(2.17±1.47)vs.(28.33±3.93)，P<0.01]，見圖4。

*：P<0.01,與原位組比較。

圖4 皮下移植瘤及原位移植瘤血管數目比較(SP染色×200)

3 討 論

胃癌是全世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，胃癌的發病率及病死率均較高。胃癌早期診斷率低，缺乏特異性早期表現，多數患者確診時已屬中晚期，失去手術根治機會，預后極差，中位生存期僅為6～10個月[1]。目前，大部分胃癌相關死亡事件是由腫瘤的轉移行為所引起的[5]。早期發現遠處轉移是提高胃癌治愈率、改善患者預后的有效及關鍵途徑。

腫瘤轉移浸潤是一個復雜的過程，腫瘤細胞從原位癌中脫離，隨血液分散至身體各部，形成新的癌灶。早在19世紀中葉，人們已經在腫瘤患者體內發現了一種“異質”細胞，并且認識到血液是傳播它的主要途徑，但由于條件所限，一直沒有進行深入研究[6]。直到最近，由于技術手段的發展，才有機會認識它，更重要的是，將CTC用于臨床腫瘤的診斷、監測及治療[7]。因此，在外周血中檢測到CTC對解決復發轉移監測、腫瘤分子特征等臨床問題有重要的應用價值。CTC是腫瘤血行轉移過程中的關鍵步驟，提供了原發性與轉移性腫瘤之間的聯系。如何利用CTC控制腫瘤轉移侵襲，是一個迫切需要被深入發掘及研究的重要問題。

CTC與其他有創手段獲取腫瘤標本有不可比擬的優勢，血液來源的CTC，標本采集容易、創傷性小、患者依從性較好，是臨床上較為理想的標本來源。目前CTC在臨床中的應用主要包括以下幾個方面。(1)腫瘤的診斷：對于一些隱匿部位的腫瘤，雖然臨床高度懷疑，但在沒有病理診斷的情況下，臨床的診斷及治療相當棘手。所以，如果能在外周血獲得CTC，并進行相關的病理學、分子生物學分析，對臨床腫瘤的診斷治療有極大的幫助，故CTC作為無創的實時液體活檢標本有重要的意義[8]。(2)指導個體化治療：在腫瘤靶向治療中，臨床策略的決定主要根據患者原發腫瘤的基因表型，但在治療過程中，腫瘤的基因表型很可能發生改變，CTC為整個療程中的腫瘤基因表型提供實時監測，為精準的個體化治療提供了可能[9]。(3)治療效果及預后的評估：外周血中CTC的數目是評估預后的良好指標，研究表明，在多種腫瘤中，CTC的計數是腫瘤預后的獨立影響因素[10]。

目前，CTC在臨床的運用越來越多。Sastre等[11]采用CellSearch系統監測結腸癌患者，證實CTCs陽性率與原發腫瘤部位、腫瘤分化程度及癌胚抗原(CEA)水平升高無關，但與結腸癌的臨床分期相關，且CTCs在結腸癌的早期階段即可檢測到，表明CTCs檢測有助于早期發現結腸癌及可能出現的微轉移。Cristofanilli等[12]在一個多中心、前瞻性和雙盲臨床試驗中，檢測177例轉移性乳腺癌患者7.5mL外周血中CTCs的數量，發現治療前外周血中CTCs≥5的患者與CTCs<5的患者相比，預后較差，因此CTCs可作為轉移性乳腺癌患者預后評估的獨立預測因素。有研究者運用熒光原位雜交(FISH)技術發現，38%的轉移性乳腺癌患者原發腫瘤組織呈人表皮生長因子受體-2(HER-2)陰性，而分離并富集的外周血CTCs能夠擴增到HER-2基因，根據CTCs的HER-2擴增情況適時調整治療方案，能夠獲得更好的治療效果[13]。監控CTCs的HER-2基因表達，進行有針對性的個體化治療是對乳腺癌患者傳統治療觀念的改進。Smerage等[14]在595例轉移性乳腺癌患者外周血中檢測CTCs，結果表明，CTCs是強烈的預后因子。因此，CTCs檢測對早期發現腫瘤微轉移、評估預后及腫瘤的個體化治療等具有重要意義，而且由于檢測標本是外周血，侵襲性小，可重復進行，所以CTCs檢測技術具有廣闊的臨床應用前景。

目前，CTCs在胃癌領域的研究較少，尚需通過更多大規模、多中心的隨訪研究深入探討其在評估患者療效、預后和監測復發轉移方面的應用價值，從而為腫瘤的合理化及個體化治療奠定基礎。動物模型是探討CTC臨床運用的前提，目前迫切需要找到一個經濟、好用，能夠反應CTC臨床特征的動物模型，但目前還缺乏這方的研究。

在本研究中，作者采用了4種常用的胃癌造模手段，包括皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤4種。采用免疫磁珠法分離外周血中CTC，它是目前比較常用的CTC分離和富集技術[15]。其原理是基于CTCs主要表達上皮源性表面標志，利用抗原抗體方法分離和富集CTCs，通過磁珠偶聯上皮細胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule,Ep-CAM)和細胞角蛋白(cytokeratins,CKs)等標志直接富集外周血中上皮來源的細胞。對于富集的CTC，作者采用單細胞RT-QPCR進一步分析原細胞與CTC基因表達差異。RT-QPCR不僅高度敏感，而且具有高度特異性。它相比于RT-PCR的主要優勢是通過Cq值的形式，設置截斷水平，以減少基于錯誤轉錄的假陽性結果[16]。目前，已有部分研究采用RT-QPCR技術分析CTC腫瘤預后標志物表達水平，包括HER-2[17]、TWIST1[18]、CD133[19]、表皮生長因子受體(EGFR)[20]、間質表皮轉化因子(MET)[21]和血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)[22]。但是，目前大部分研究采用全血細胞進行RT-QPCR，其主要缺陷是不能排除白細胞的污染，假陽性概率增高，并且不能區分1份樣品中多個循環腫瘤細胞基因表達差異。由于這個缺點，作者采用單細胞RT-QPCR技術進行CTC基因表達分析。將單細胞平臺篩選出的CTC行CD45初篩，對于CD45-的細胞進一步行轉移相關基因表達檢測。CD45在白細胞中有高表達，而在其他各種來源的細胞中無表達，這樣可以有效去除血液中其他細胞的污染。

本研究結果表明，皮下移植瘤不能形成CTC，尾靜脈注射法雖然在前2周CTC數目多，在接種第4周，已有一半裸鼠死亡，可能與尾靜脈注射法技術難度大，操作困難有關。而腹腔注射組CTC數目較少，轉移部位較局限，不是構建CTC的理想方案。原位接種裸鼠死亡率低，CTC數目多，且轉移范圍較廣，是一種比較成功的構建CTC模型的方法。 進一步單細胞mRNA研究表明，與SGC7901相比，體內單細胞CTCMMP2、VEGFmRNA表達明顯增加，而E-cadherinmRNA表達明顯減少。原位胃癌的血管數目明顯多于皮下移植瘤，可見在體內環境下，CTC轉移相關基因表達增強，抑制轉移相關基因表達減弱，腫瘤血管生成增多，導致腫瘤轉移能力明顯增強。

綜上所述，腫瘤復發轉移是造成腫瘤致死的主要原因，早期準確檢測CTC對腫瘤患者的綜合治療至關重要，并且可能作為胃癌治療監測、評估預后、復發轉移風險預測的評估指標，有助于選擇個體化治療方案，從而降低腫瘤復發率，延長患者生存期。本實驗探索性的采用了免疫磁珠法聯合單細胞收集法收集CTC，并采用單細胞RT-QPCR檢測CTC相關基因表達，為CTC應用于臨床奠定了基礎。

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Construction of gastric cancer animal model for circulating tumor cells′ research*

ZhouZhou1，LaiBing2，GaoCaiping1，WangPu1，WangHan1，LiLiangping1

(1.DepartmentofGastroenterology,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chendu,Sichuan610072,China;2.DepartmentofFrontierBiotechnology,DiaoJiuhongPhamaceuticals,Chendu,Sichuan610041,China)

Objective To construct gastric cancer circulating tumor cell(CTC) animal models,in order to provide references for utilization of CTC in clinical practice.Methods Four kinds of gastric tumor models in nude mice were constructed,which were subcutaneously transplanted tumor,orthotopic xenograft,abdominal tumor and tail vein tumor.The tumor growth and metastatic capability were detected,and the number of CTCs in each group was compared.Furthermore,the metastasis-related gene expression changes in CTC and the original cells were detected at single cell level with RT-QPCR analysis.Immunohistochemical staining was used to determinate tumor angiogenesis.Results The orthotopic xenograft tumor model was the best model for CTC research.Nude mice death ratio,tumor metastasis and CTC number in orthotopic xenograft tumor model were all better than those of other models.Conclusion The gastric cancer CTC animal model is successfully constructed,which might lay foundation for clinical use of CTC.

gastric neoplasms；circulating tumor cells；neoplasm recurrence；neoplasm metastasis

四川省科技廳支持項目資助項目(2014TD0028)。 作者簡介：周洲(1983-)，主治醫師，博士，主要從事消化系統腫瘤的基礎臨床研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.007

R

A

1671-8348(2016)35-4917-05

2016-05-21

2016-08-09)