MicroRNA-199a通過缺氧誘導因子1α抑制胃癌細胞上皮間充質轉化

鄭 桁，張 偉，王 康

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院胃腸外科，成都 610072)

MicroRNA-199a通過缺氧誘導因子1α抑制胃癌細胞上皮間充質轉化

鄭 桁，張 偉，王 康

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院胃腸外科，成都 610072)

目的 探討微小RNA-199a(miR-199a)調節缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達對缺氧狀態下胃癌細胞上皮間充質轉化(EMT)的影響及可能的機制。方法 低氧處理胃癌細胞24h，通過轉染si-HIF-1α和miR-199amimic，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測miR-199a的表達水平，蛋白質印跡法(Westernblotting)檢測HIF-1α及相關EMT蛋白的變化，鏡下觀察胃癌細胞形態。結果 低氧處理后，能下調miR-199amRNA表達，上調HIF-1α和間葉細胞標志蛋白表達，下調E-鈣黏素(E-cadherin)蛋白表達。轉染miR-199amimic后能抑制HIF-1α的蛋白表達，轉染si-HIF-1α和miR-199amimic后能部分逆轉低氧的作用，抑制EMT過程的發展。結論miR-199a可能通過降低HIF-1α的表達抑制缺氧狀態下胃癌細胞的EMT過程的發生。

微小RNA-199a；缺氧誘導因子-1α；缺氧；上皮間充質轉化

缺氧是所有實體腫瘤的共同特征，在腫瘤的起始和發展中起重要作用。缺氧時細胞內高表達的缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)可誘導腫瘤發生上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transiton,EMT)，促進腫瘤細胞異質化和腫瘤血管形成，從而參與腫瘤的浸潤、轉移。HIF-1α在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且HIF-1α的表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期有關，HIF-1α可促進EMT的發生，從而促進胃癌的轉移[1]。EMT是具有極性的上皮細胞轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，主要特征有細胞黏附分子表達減少、間質表型細胞標志物表達增加和轉錄因子表達上調。微小RNA(microRNA,miR)作為一種非編碼單鏈RNA在EMT的發生中也發揮了重要作用。研究發現，結腸癌中miR-199a-5p的下調可以活化EMT相關信號，促進結腸癌的轉移和侵襲[2]。本研究用1%氧氣(O2)處理胃癌細胞AGS，模擬缺氧環境，觀察缺氧對胃癌細胞EMT的影響，并以miR-199a mimic和si-HIF-1α轉染胃癌細胞，分析EMT標志蛋白的表達情況及細胞形態的變化，探討miR-199a調控HIF-1α表達參與缺氧狀態下胃癌細胞EMT的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及細胞培養 胃癌AGS細胞購自中國科學院上海生科院細胞中心(來源于ATCC細胞庫)。細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，加入100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素雙抗，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的恒溫培養箱中培養。

1.2 儀器與試劑 低氧培養箱購自美國Thermo公司。胎牛血清購自天津灝洋有限公司，RPMI1640培養液購自美國Hyclone公司，lipofectAMINE2000購自美國Invitrogen公司，miR-199a和U6引物、miR-199a mimics、control mimics和si-HIF-1α由廣州銳博合成，Trizol、逆轉錄試劑盒、SyberGreen試劑盒均購自日本TaKaRa公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、一抗二抗稀釋液、超敏蛋白顯影液、β-actin一抗、羊抗兔二抗購自碧云天生物技術所，兔抗人HIF-1α、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、SNAIL抗體購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 寡核苷酸和siRNA轉染 按LipofectAMINE2000說明書操作，將miR-199a mimics(50 nmol/L)、mimic對照和si-HIF-1α(100 nmol/L)、si對照分別轉染至融合度為50%的胃癌AGS細胞中，無血清培養液培養細胞6 h后更換為完全培養基繼續培養24 h，轉染后細胞用于后續實驗。

1.3.2 AGS細胞中miR-199a mRNA表達的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測AGS細胞中miR-199a mRNA的表達。收集不同分組的AGS細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，按Trizol試劑盒說明抽提細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA水平和260與280 nm處的吸光度(A)值比值(A260/A280)，取100 ng總RNA按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板加入miR-199a或U6上下游引物(由廣州銳博合成)，和SybrGreen進行PCR擴增。條件：第1步，95 ℃ 30 s；第2步，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環。以2-△△CT值計算各樣本中miR-199a的相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.3 HIF-1α及EMT相關標志蛋白的表達 采用蛋白質印跡法(Western blotting)檢測HIF-1α及EMT相關標志蛋白的表達。收集不同分組的AGS細胞，提取總蛋白，BCA檢測蛋白水平，按40 g計算蛋白質上樣體積，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(HIF-1α稀釋比例為1∶500，其余稀釋比例為1∶1 000)，Tris緩沖生理鹽水-吐溫溶液(TBST)洗膜3次，二抗(抗兔1∶5 000，β-actin為抗鼠二抗1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，化學發光法顯影。

1.3.4 倒置光學顯微鏡下觀察AGS細胞形態 收集轉染control、1% O2、+miR-199a mimics、+control mimics處理后的AGS細胞，在倒置光學顯微鏡下隨機選擇3個視野(×200)，觀察細胞的形態變化，并進行拍照。

2 結 果

2.1 低氧上調HIF-1α的表達 1%O2處理胃癌細胞24h后，與常氧組比較，低氧可以誘導HIF-1α表達，而si-HIF-1α轉染后能明顯抑制HIF-1α的表達，si陰性對照組對HIF-1α表達無明顯影響，見圖1。

圖1 Western blotting檢測HIF-1α表達

2.2si-HIF-1α抑制胃癌EMT為了研究HIF-1α對胃癌細胞EMT的影響，將si-HIF-1α轉染入AGS細胞內48h后低氧處理24h，WesternBlotting檢測胃癌細胞株AGS中上皮細胞標志物E-鈣黏素(E-cadherin)和間葉細胞標志物纖維連接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和SNAIL蛋白的表達。結果顯示：與常氧組比較，低氧可誘導胃癌細胞間葉細胞標志物表達上調，而轉染si-HIF-1α后，間葉細胞標志物表達明顯降低，E-cadherin蛋白表達上調，見圖2。

2.3 低氧下調miR-199a的表達 1%O2處理胃癌細胞24h后，與常氧組比較，低氧可以下調miR-199amRNA的表達，而轉染miR-199amimic后能明顯上調miR-199a的表達，mimic對照組對miR-199a表達無明顯影響，見圖3。

圖2 Western blotting檢測EMT相關蛋白表達

*：P<0.01，與常氧組比較；#：P<0.01，與低氧組比較；n=3。

圖3miR-199amRNA表達

圖4 Western blotting檢測HIF-1α表達

圖5 Western blotting檢測EMT相關蛋白表達

2.4 過表達miR-199a通過HIF-1α抑制胃癌EMT實驗證明，轉染miR-199amimic后能明顯抑制HIF-1α的表達，見圖4，并上調上皮細胞標志物E-cadherin蛋白水平，抑制間葉細胞標志物的表達。mimiccontrol組對上述蛋白表達無明顯影響，見圖5。

2.5 過表達miR-199a對胃癌細胞形態變化的影響 在倒置光學顯微鏡下觀察發現，低氧24h胃癌細胞中長梭形細胞明顯增加，而轉染miR-199amimics后細胞由長梭形變為多角形或卵圓形，見圖6。

A:常氧組;B:低氧組;C:+miR-199amimics組;D:mimic對照組。

圖6 倒置顯微鏡下觀察miR-199amimics轉染對低氧處理后胃癌細胞的形態影響(×200)

3 討 論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人們的健康安全。胃癌轉移是影響胃癌患者療效和獲得長期生存的關鍵問題。近年來多項研究證實，多種miRNA在胃癌中的表達異常，導致癌基因的激活和抑癌基因缺失，從而調控癌細胞的增殖和生長。

本研究探討了低氧對胃癌細胞EMT的影響，1%O2處理后，上皮相關指標E-cadherin表達水平明顯下調，而vimentin、N-cadherin和SNAIL蛋白表達水平明顯升高，提示EMT的發生，同時細胞內HIF-1α蛋白表達上調，這一結果說明缺氧環境下HIF-1α蛋白表達上調可導致EMT的發生。miRNA能與癌基因或抑癌基因的3′-非翻譯區(3′-untranslatedregion，3′-UTR)特異性結合，通過對靶基因mRNA的降解或轉錄后調控抑制基因的表達，從而在腫瘤的發生、發展中起重要作用。生物信息學預測分析HIF-1α可能為miR-199a的靶基因，目前已有研究通過Westernblotting和雙熒光素酶報告基因實驗證實HIF-1α為miR-199a的靶基因[3-4]，本實驗也證明了miR-199amimic可以下調HIF-1α的蛋白表達。在難治性癲癇患者的癲癇組織[5]、酒精性肝病肝竇內皮細胞[6]和多發性骨髓瘤細胞[7]中，miR-199a表達下調，HIF-1α表達上調，過表達miR-199a后可下調HIF-1α。接下來作者檢測了在缺氧條件下胃癌細胞中miR-199a的表達水平，結果發現miR-199a在缺氧狀態下表達下調，而轉染miR-199amimics可部分逆轉缺氧導致的EMT相關蛋白的變化，倒置光學顯微鏡下觀察也可見細胞由缺氧狀態時的長梭形轉變為多角形或卵圓形，說明胃癌細胞EMT減少。這一結果進一步證實，miR-199a能抑制胃癌細胞的EMT過程。

低氧可通過轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路、Notch信號通路、Wnt信號通路、刺猬信號通路、肝細胞生長因子/肝細胞生長因子受體信號通路及多種轉錄因子等途徑參與腫瘤EMT調控[8]。在缺氧狀態下，腫瘤細胞中TGF-β表達增加，低氧可通過直接提高SMAD3mRNA水平影響TGF-β信號通路[9]；反之，TGF-β通過SMAD信號通路特異性減少脯氨酰羥化酶的表達，從而間接增強HIF-1α蛋白的穩定性[10]。在腫瘤缺氧微環境中，HIF-1α與Notch信號通路細胞內結構域功能性結合，增強轉錄活性，提高轉錄因子SNAIL表達水平，從而導致EMT[11-12]，而HIF-1α與Notch信號通路可能是通過HES1依賴的SRC/轉錄激活子3(STAT3)通路發揮作用[13]。腫瘤低氧環境中，HIF-1α通過N端區域將β-catenin從T細胞因子-4(TCF-4)移除，結合N-乙?；D移酶基因hARD1使β-catenin失活，雖然HIF-1α可抑制β-catenin的轉錄活性，但低氧環境對β-catenin誘發的EMT是必要的[14]。Wnt/β-catenin信號能通過增加EMT相關的HIF-1α蛋白活性和抑制腫瘤死亡，加速缺氧誘導的EMT進展[15]。

綜上所述，本研究表明在缺氧狀態下，胃癌細胞內上調的HIF-1α可誘導EMT的發生，過表達miR-199a可通過抑制HIF-1α從而抑制EMT過程，為胃癌細胞的靶向治療提供新的線索。

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MicroRNA-199a inhibits EMT process in AGS cell by regulating HIF-1α gene expression

ZhengHeng，ZhangWei，WangKang

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China)

Objective To investigate the effect of microRNA-199a(miR-199a) on hypoxia epithelial-mesenchymal transition(EMT) of gastric carcinoma by regulating hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) gene expression and its probable mechanism.Methods After hypoxia for 24 h,si-HIF-1α and miR-199a mimic were transfected to gastric cancer cells.The expression levels of miR-199 was detected by using quantitative real-time PCR.The levels of HIF-1α and related protein in EMT were examined by Western blotting.Gastric cancer cell morphology were observed with an inverted microscope.Results After hypoxia,the expression levels of miR-199a mRNA and E-cadherin protein were decreased,and the expression levels of HIF-1α and mesenchymal cell marker protein were increased.After transfection of miR-199a mimic,the expression of HIF-1α was inhibited.Then,the transfection of si-HIF-1α and miR-199a mimic could partially reverse the effect of hypoxia and inhibit the development of EMT process.Conclusion miR-199a could suppress the transition process and EMT process under hypoxia,it is may be achieved by down-regulating HIF-1α gene expression.

miR-199a；hypoxia inducible factor-1α；hypoxia；epithelial-mesenchymal transiton

鄭桁(1974-)，主治醫師，碩士，主要從事胃腸外科及胃腸腫瘤方面的研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.006

R

A

1671-8348(2016)35-4914-03

2016-05-18

2016-08-06)