新生期大鼠反復驚厥后8-OH-dG和CytC的表達與細胞凋亡的關系研究

劉月影，王春紅，崔 盈，倪 宏

(1.江南大學附屬醫院兒科，江蘇無錫 214062；2.蘇州大學附屬兒童醫院神經病學研究室，江蘇蘇州 215003)

新生期大鼠反復驚厥后8-OH-dG和CytC的表達與細胞凋亡的關系研究

劉月影1，王春紅1，崔 盈1，倪 宏2

(1.江南大學附屬醫院兒科，江蘇無錫 214062；2.蘇州大學附屬兒童醫院神經病學研究室，江蘇蘇州 215003)

目的 探討新生期大鼠反復驚厥后8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷(8-OH-dG)和細胞色素C(CytC)的表達與細胞凋亡的關系。方法 將24只日齡8d的大鼠分為驚厥組和對照組，驚厥組進一步分為驚厥后3h、24h、48h，每組6只。采用吸入三氟乙醚誘導新生期大鼠反復驚厥持續狀態模型，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清8-OH-dG水平，實時熒光定量PCR(RT-PCR)和原位末端標記法(TUNEL)分別檢測海馬CytC的表達和細胞凋亡。結果 與對照組相比，TUNEL顯示驚厥組海馬神經元細胞凋亡明顯增多(P<0.01),呈棕黃色顆粒。血清8-OH-dG水平在末次驚厥后各時間點均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。與對照組相比，CytC在末次驚厥后3h、24h增高(P<0.01)，48h后下降至正常水平。8-OH-dG、CytC與細胞凋亡呈正相關(r=0.662、0.565,P<0.05)。結論 線粒體損傷可能參與了發育期反復驚厥后腦損傷。

反復驚厥；8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷；細胞色素C；細胞凋亡；新生大鼠

線粒體途徑是細胞凋亡的重要途徑[1]。當有害物質如活性氧自由基等作用于線粒體，一方面可以使線粒體內膜通透性增高,線粒體腫脹，外膜破裂，線粒體凋亡標志物細胞色素C(CytC)釋放至胞質，通過激活Caspase家族誘發細胞凋亡；另一方面可以通過線粒體DNA 鏈斷裂、位點突變、雙鏈畸變及DNA堿基的氧化損傷等形式造成 DNA 損傷，進一步導致細胞凋亡，8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷(8-OH-dG)作為損傷DNA后形成的最常見產物，是DNA損傷的重要指標[2]。線粒體作為細胞內的重要細胞器在癲癇發病中的作用已受到學者的廣泛關注[3]。本研究擬通過建立新生期反復驚厥大鼠模型，觀察反復驚厥發作后8-OH-dG 和CytC的表達及其與細胞凋亡的關系，探討線粒體損傷在發育期反復驚厥腦損傷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24只日齡 8 d 的健康 SD 大鼠，體質量 18.23～21.79 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[許可證號 SCXK(滬)2012-0002]。大鼠分為驚厥組和對照組，驚厥組進一步分為驚厥后3 h、24 h、48 h亞組，每組6只。

1.1.2 主要儀器與試劑 三氟乙醚 (Aldrich Chem．Co.PO．Box355，美國)密封避光保存；8-OH-dG試劑盒(Cayman Chemical Company，美國)；TUNEL試劑盒 (Boehringer Mannheim，德國)；Trizol(Invitrogen Life Technologies，美國)；逆轉錄酶、核糖核苷酸酶抑制劑(Invitrogen，美國)； Light Cycler 2.0 PCR儀(Roche，德國)；RT6000型酶標儀(霄杜生命科學有限公司，深圳)；引物根據Gene Bank核酸序列，Premier 3.0軟件設計，上海生工公司合成。Cyt-C：上游引物為5′-GGT GAT GTT GAA AAA GGC AAG AA-3′，下游引物為5′-TGC TTG CCT CCT TTT TCC A-3′；β-actin：上游引物為5′-GAC AGG ATG CAG AAG GAG ATT ACT-3′，下游引物為5′-TGA TCC ACA TCT GCT GGA AGG T-3′。

1.2 方法

1.2.1 新生期大鼠反復驚厥模型的建立 采用三氟乙醚按照田甜等[4]的方法致反復驚厥，使驚厥持續30 min；每天誘導1次，連續7 d(驚厥組)；對照組除不給予三氟乙醚外其他處理與驚厥組相同。

1.2.2 標本的制備和取材 取對照組和反復驚厥后3、24、48 h大鼠各6只，10%水合氯醛麻醉后心臟取血，并立即斷頭，冰上取一側海馬-80 ℃保存備用于實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測CytC表達水平；另一半腦組織立即置于10%的多聚甲醛中固定，用于制作石蠟標本進行蘇木精-伊紅(HE)、原位末端標記法(TUNEL)染色；取出的血液靜置1 h后4 ℃ 1 800 r/min離心10 min，取上清液，分裝于EP管中，立即置于-80 ℃保存備用，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測8-OH-dG水平。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 取10%多聚甲醛溶液中固定1周以上的腦組織，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，切片，脫蠟，TUNEL法檢測細胞凋亡。操作過程按凋亡試劑盒說明書進行，在高倍視野下(×400)選6個不同的視野，計算各個視野的陽性細胞數(胞核呈棕黃色顆粒)。

1.2.4 ELISA法檢測血清8-OH-dG水平 檢測前取出-80 ℃保存標本，常溫解凍，所有標本均為同批測定。各項操作嚴格按試劑盒說明進行，每份標本重復3次，取其均值。結果基于每次8-OH-dG標準溶液實驗的線形校正曲線計算，所得數據以每微克DNA所含的8-OH-dG的皮克數(pg/μg)表示。

1.2.5 RT-PCR法檢測CytC mRNA的表達 參照 Trizol試劑說明書，提取海馬的總RNA并逆轉錄cDNA。PCR 擴增采用SYBR Premix ExTaq探針法。PCR 反應用β-actin 作為內參，反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，循環45次。繪制擴增曲線，反應結束后得到各反應管的循環閾值(Ct)，將目的基因CytC的Ct值與內參基因β-actin的Ct值相減得到校正的目的基因CytC的Ct值，即△Ct，CytC基因相對表達量以2-△Ct表示。

2 結 果

2.1 凋亡細胞TUNEL染色及計數結果 海馬CA1區，對照組少見TUNEL陽性細胞，細胞核呈深染棕褐色(圖1A)，驚厥組末次驚厥后3h凋亡細胞開始明顯表達，高峰表達主要出現于末次驚厥后24h(圖1B),末次驚厥后48h可見陽性細胞開始衰減。驚厥組末次驚厥后3、24、48h凋亡細胞數均高于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.01)，見表1。

A:對照組;B:驚厥組末次驚厥后24h。

圖1 大鼠海馬CA1區TUNEL染色凋亡細胞表達(×400)

2.2 血清8-OH-dG水平的動態變化 與對照組相比，驚厥組血清8-OH-dG水平在末次驚厥發作后 3、24、48h均升高(P<0.05或P<0.01)；其中末次驚厥后24h增高最明顯，見表1。

2.3CytCmRNA表達水平的動態變化 與對照組相比，驚厥組大鼠CytC表達在末次驚厥后3h升高，持續至驚厥發作后24h(P<0.01)，在驚厥發作后48h下降至正常水平，見表1。

表1 新生期大鼠反復驚厥后不同時間點細胞凋亡情況及8-OH-dG、CytC的表達

*P<0.05，#P<0.01,與對照組比較。

2.4 相關性分析 血清8-OH-dG水平及CytCmRNA表達水平均與凋亡細胞數呈正相關(r值分別為0.662、0.565，P值分別為0.001、0.003)。

3 討 論

研究表明，細胞凋亡是反復驚厥發作后腦損傷的主要形式[5]。在細胞凋亡的死亡受體、內質網信號和線粒體信號3條途徑中，線粒體途徑是中樞神經系統疾病較重要的細胞凋亡途徑[6]。

線粒體既是能量代謝和細胞呼吸的重要場所，更是細胞凋亡的中心[7]。而CytC是線粒體電子傳遞鏈的重要組成部分，其既參與線粒體能量代謝，當其釋放到細胞質中又直接參與細胞凋亡的調節。大量實驗研究發現CytC從線粒體釋放到細胞質是多種細胞凋亡的共同表現，在細胞凋亡過程中起關鍵作用，敲除CytC基因的細胞能對刺激因素誘導的凋亡具有明顯的耐受性[8]。已有研究表明，癲癇發作后N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受體激活,鈣超載、活性氧等可引起線粒體的通透性轉運孔開放，CytC釋放至細胞質[9]。CytC與凋亡蛋白活化因子-1(Apaf-1)及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9形成CytC/Apaf-1/Caspase-9復合體，作用于下游的Caspase-3，從而誘發細胞凋亡[10]。本研究發現，CytC在反復驚厥發作后海馬組織中表達量明顯增加，并在3h時呈現出明顯表達，持續至驚厥發作后24h。結合本課題組前期對反復驚厥后Caspase-3表達變化在12h出現峰值的研究結果發現[11]，CytC從線粒體中釋放后，可進一步激活下游的Caspase-3級聯反應誘導細胞凋亡；本研究TUNEL法亦顯示在驚厥發作后24h海馬CA1區細胞凋亡達到高峰，CytC和凋亡細胞數呈正相關，進一步說明CytC與細胞凋亡有關。但末次驚厥發作后48hCytC已經回落到正常水平，而細胞凋亡仍有輕度升高，提示CytC增高后通過Caspase-3級聯反應等機制才能誘導細胞凋亡的發生，存在一定的后續效應，進一步支持上述觀點。

氧化應激是導致驚厥發作后腦損傷的重要途徑，在動物實驗及人體內都證實，驚厥發作后氧化應激與驚厥發作后細胞凋亡有關[12-13]。在機體內存在氧化和抗氧化兩大系統，大量的實驗證實，在驚厥發作后該系統失衡，氧化系統被激活，抗氧化物酶活性降低，腦防御氧自由基功能受損或降低，機體的總抗氧化能力下降，活性氧產生過多和聚集，進一步誘導細胞凋亡[14]。DNA損傷是氧化損傷的重要表現之一[2]，線粒體DNA是DNA的重要組成部分，在機體內發揮重要功能。當機體受到外界刺激時，DNA鏈上鳥嘌呤G被氧化為8-OH-dG，可導致基因發生G→T突變,8-OH-dG的部位還易發生堿基脫落和DNA鏈斷裂。因此,檢測DNA氧化損傷產物 8-OH-dG表達,將為探討DNA氧化損傷與反復驚厥后腦損傷發生的關系提供生物標志[15]。本實驗研究顯示，反復驚厥發作后8-OH-dG持續增高至驚厥發作后48h，提示在反復驚厥發作后存在DNA損傷。8-OH-dG與細胞凋亡的相關性分析顯示，二者之間呈正相關，但8-OH-dG先于細胞凋亡下降，提示DNA損傷后可能通過一系列的機制才能進一步導致細胞凋亡的發生，與Qiu等[16]的研究結果相似。

綜上所述，新生期反復驚厥后存在細胞凋亡，線粒體途徑在細胞凋亡過程中發揮重要作用。線粒體損傷及可能的修復途徑是一個非常復雜的過程，涉及眾多因子的參與，還待更進一步的深入研究，從而為治療發育期驚厥性腦損傷提供新的思路和治療靶點。

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The relationship between the expression of 8-OH-dG，CytC and apoptosis in neonatal rats with recurrent seizures*

LiuYueying1，WangChunhong1，CuiYing1，NiHong2

(1.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofJiangnanUniversity,Wuxi，Jiangsu214062，China； 2.NeurologyLaboratory,Children′HospitalofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215003，China)

Objective To investigate the relationship between the expression of 8-OH-dG,CytC and cell apoptosis in neonatal rats with recurrent seizures.Methods Totally 24 eight-day-old SD rats were randomly divided into two groups:the recurrent seizures group(RS group,30 minutes seizure induced of flurothyl once per day for 7 consecutive days) and control group(CON group,rats were treated without flurothyl).At designated time points(CON group,3,24,48 h after the last seizure in RS group),the hippocampus of six rats from each group were rapidly dissected out after blood drawn from heart.The 8-OH-dG was detected by ELISA method.The expression of CytC and apoptosis were detected by RT-PCR and TUNEL method respectively.Results Compared with the CON group,TUNEL showed that the apoptotic cell counts in RS group were rapidly increased，especially at 24 h after the last seizures[(54.83±7.16)cells/HPFvs. (15.16±2.48)cells/HPF，P<0.01]．In RS group，the serum levels of 8-OH-dG were significantly higher than that in CON group,particularly at 24 h after the last seizures[(1.263 83± 0.221 30)pg/μgvs.(0.822 16±0.039 380)pg/μg,P<0.01].The expression level of CytC mRNA significantly increased at 3 h after the last seizures(0.114 36±0.005 28vs. 0.093 01±0.009 79,P<0.01) and at 24 h after the last seizures(0.105 62±0.007 26vs. 0.093 01±0.009 79,P<0.01),then decreased to normal level.There were obviously positive correlation between 8-OH-dG,CytC and apoptosis(r=0.662,0.565;P<0.05).Conclusion The levels of 8-OH-dG and CytC were significantly up-regulated and had positive correlation with apoptosis,suggesting that mitochondrial damage might be involved in the brain injury after the recurrent seizures in neonatal rats.

recurrent seizures；8-OH-dG；CytC ；cell apoptosis；neonatal rats

國家自然科學基金資助項目(81471337)；無錫市衛計委科研項目(MS201518)。 作者簡介：劉月影(1975-)，副主任醫師，碩士，主要從事小兒神經系統疾病臨床研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.004

R

A

1671-8348(2016)35-4908-03

2016-07-12

2016-10-21)