下調PTEN基因對慢性偏頭痛大鼠NR2B亞基酪氨酸磷酸化和一氧化氮的影響

李王文，秦光成，陳力學△，謝景梅，吳白雪，周冀英

(重慶醫科大學附屬第一醫院：1.實驗研究中心；2.神經內科，重慶 400016)

下調PTEN基因對慢性偏頭痛大鼠NR2B亞基酪氨酸磷酸化和一氧化氮的影響

李王文1，秦光成1，陳力學1△，謝景梅1，吳白雪1，周冀英2

(重慶醫科大學附屬第一醫院：1.實驗研究中心；2.神經內科，重慶 400016)

目的 利用RNAi重組腺病毒下調第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)的表達，探討PTEN基因對慢性偏頭痛大鼠三叉神經脊束核尾核(TNC)內N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基酪氨酸磷酸化(NR2B-pTyr)蛋白表達水平和一氧化氮(NO)含量的影響。方法 將SD雄性大鼠分為對照組、對照干預組、模型組和模型干預組。硬腦膜滴注炎性湯(IS)建立慢性偏頭痛大鼠模型，TNC注射AdR-siPTEN，7 d后觀察大鼠行為學改變，檢測大鼠TNC內PTEN、NR2B-pTyr和NO含量。結果 AdR-siPTEN可下調慢性偏頭痛大鼠模型TNC中PTEN的表達；與模型組比較，IS干預慢性偏頭痛大鼠的行為學癥狀明顯緩解，大鼠的TNC內NR2B-pTyr表達水平及NO水平明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 PTEN參與調節慢性偏頭痛的病理過程，下調PTEN基因可緩解IS誘導的慢性偏頭痛大鼠的疼痛行為學，其機制可能與下調PTEN引起NR2B-pTyr表達量及NO水平降低有關。

慢性偏頭痛；第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因；N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基；磷酸化；一氧化氮

偏頭痛(migraine)是一種反復發作的、一側或雙側搏動性的劇烈頭痛，發作時常伴隨惡心、嘔吐、畏光和畏聲等癥狀[1]。根據國際頭痛協會(IHS)國際頭痛疾病分類第2版(ICHD-Ⅱ)的標準，偏頭痛反復發作(每個月不少于15 d)，持續3個月以上，無藥物濫用，即為慢性偏頭痛(chronic migraine，CM)。CM已被WHO列為四大最嚴重的慢性功能障礙性疾病之一，其發病機制尚不明確，目前多認為神經源性炎癥引起的中樞致敏與CM的發病相關。神經源性炎癥所致的神經元N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的異常激活是產生疼痛及痛覺維持的重要機制，NMDAR的性質在很大程度上由其亞單位NR2B所決定，其中NR2B酪氨酸磷酸化(NMDAR2B tyrosine phosphorylation,NR2B-pTyr)水平升高是誘導和維持慢性疼痛炎癥性痛覺過敏的主要原因之一[2]。

RNAi重組腺病毒下調第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是一個近年來新發現的，同時具有脂質和蛋白質雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其廣泛分布于中樞神經系統，不僅對神經系統的發育及正常功能的維持具有重要作用，同時與腦缺血、癲癇、藥物成癮性等神經精神障礙疾病的發生密切相關。已有研究報道，下調PTEN基因可降低NR2B的表達和一氧化氮(NO)的水平，緩解偏頭痛的發作[3]。為此本文通過AdR-siPTEN重組腺病毒下調PTEN基因，觀察炎性湯誘導的CM大鼠行為學的變化，同時探討PTEN是否可通過調節NR2B-pTyr影響NO的合成，繼而抑制CM的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的分組及大鼠CM模型的建立 清潔級Sprague Dawley(SD)成年雄性大鼠，體質量(210±30)g，各項實驗均每組6只，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。參見Oshinsky等[4]和Stucky等[5]的方法稍作改動，建立大鼠CM模型。將大鼠頭部建立炎性湯[IS，包含1 mmol/L組織胺、1 mmol/L 5-羥色胺、1 mmol/L緩激肽、0.1 mmol/L前列腺素E2的磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH 7.4，美國Sigma公司]誘導窗，植入微量給藥系統1周后，選擇傷口未感染的24只實驗大鼠入實驗組，將其分為以下4組：對照組(Sham組)、對照干預組(Sham+AdR-siPTEN組)、模型組(IS組)、模型干預組(IS+AdR-siPTEN組)，每組6只。實驗大鼠硬腦膜下每次泵入炎性湯10 μL，3次/周，連續3周，建立CM大鼠模型，對照組大鼠硬腦膜下泵入等體積生理鹽水。造模結束后，PTEN干預組立即定位三叉神經脊束核尾核(TNC,在前囟后14.6 mm、中線旁開2.5 mm、深9.0 mm)，用微量注射器緩慢注射重組腺病毒AdR-siPTEN 5 μL。1周后取大鼠TNC，做連續冰凍切片，厚15 μm，在熒光顯微鏡下觀察TNC中熒光蛋白的表達。本研究中動物實驗符合本院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 實驗大鼠行為學觀察 最后一次泵入IS或生理鹽水后，用大鼠自主活動行為分析儀(淮北正華公司)觀察大鼠撓頭、咬尾、爬籠、往返運動的次數總和(每個癥狀出現1次計1分)等行為學癥狀90 min。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測PTEN基因mRNA表達 各實驗組大鼠在3.5%水合氯醛麻醉下，快速斷頭分離出TNC，立即放入液氮中速凍。用Trizol法提取總RNA，根據日本Toyobo逆轉錄試劑盒說明進行操作。PCR總反應體系25 μL。引物序列：PTEN(362 bp)上游序列：5′-TTG AAG ACC ATA ACC CAC C-3′，下游序列：5′-AGT TCC GCC ACT GAA CAT-3′；三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，470 bp)上游序列：5′-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3′，下游序列：5′-ACC AGT GGA TGC AGG GAT-3′。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s。72 ℃延伸30 s，擴增35個循環，最后72 ℃延伸5 min，以GAPDH為內參照。將PCR產物在l %的瓊脂糖凝膠中進行電泳，用Quantity One軟件進行電泳條帶吸光度(A)值分析，以PTEN/GAPDH積分吸光度值的比值表示基因表達水平。

1.2.3 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測蛋白質的表達 取各實驗組大鼠TNC組織塊，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG)分離、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，按1∶500分別加入兔抗PTEN抗體、兔抗NR2B-pTyr抗體，4 ℃孵育過夜。次日吐溫20的Tris緩沖生理鹽水(TBST)洗膜后再按1∶500 0加入羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜。化學發光試劑于暗室自顯影，凝膠成像系統測定積分吸光度值分析結果。以β-actin蛋白作為內參照。

1.2.4 NO水平的測定 取各組大鼠TNC組織塊，稱重后用眼科剪盡快剪碎，加入預冷的勻漿介質[(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-Na2)，0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液]勻漿，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液0.5 mL，根據NO測定試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所)測定組織NO水平。

2 結 果

2.1AdR-siPTEN在大鼠TNC的轉染效果AdR-siPTEN轉染的大鼠TNC有紅色熒光蛋白表達(圖1)，表明PTEN基因腺病毒轉染成功。

圖1 AdR-siPTEN轉染的TNC顯示紅色熒光(×200)

2.2 大鼠行為學的變化 第9次注射IS的模型組大鼠出現前肢頻繁撓頭、雙耳發紅、爬籠次數增多、往返運動等不適癥狀，表明造模成功。模型組與對照組、模型干預組、對照干預組的行為學評分比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；對照組、模型干預組與對照干預組的行為學評分比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖2 各組實驗大鼠行為學評分

2.3 大鼠TNC中PTENmRNA檢測結果RT-PCR結果顯示，對照組與對照干預組、模型干預組間PTEN基因mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；模型組與對照干預組、模型干預組比較，差異亦有統計學意義(P<0.05)，見圖3。表明重組腺病毒AdR-siPTEN能有效抑制TNC中PTEN基因mRNA表達。

2.4 大鼠TNC中PTEN和NR2B-pTyr蛋白表達Westernblotting結果顯示，對照組PTEN基因蛋白表達水平高于對照干預組與模型干預組，差異均有統計學意義(P<0.05)；模型組PTEN基因蛋白表達水平高于對照干預組與模型干預組，差異亦有統計學意義(P<0.05)，見圖4；表明重組腺病毒AdR-siPTEN能有效抑制TNC中PTEN蛋白表達。與模型組比較，模型干預組NR2B-pTyr蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；模型干預組與對照組NR2B-pTyr蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；模型組與對照組比較，NR2B-pTyr蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。表明IS誘導的CM大鼠TNC中NR2B-pTyr蛋白表達水平明顯增高，而重組腺病毒AdR-siPTEN能明顯抑制TNC中NR2B-pTyr蛋白表達。

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖3 各組大鼠TNC內PTEN基因mRNA的表達

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖4 各組大鼠TNC內PTEN蛋白表達

2.5 大鼠TNC中NO水平比較 與模型組比較，模型干預組NO水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；模型干預組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6。表明IS誘導的CM大鼠模型TNC中NO水平明顯增高，而重組腺病毒AdR-siPTEN能明顯降低TNC中NO水平。

*：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖5 各組大鼠TNC內NR2B-pTyr蛋白表達

*：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖6 各組大鼠TNC內NO水平比較

3 討 論

本研究結果發現，利用AdR-siPTEN重組腺病毒，可以使CM模型大鼠咬尾、撓頭次數和爬籠等行為學癥狀明顯緩解，降低TNC中PTEN基因mRNA和蛋白的表達水平。同時下調PTEN基因后，大鼠TNC的NR2B-pTyr和NO水平也顯著降低。上述結果表明，PTEN基因可能通過降低NR2B-pTyr和NO水平，參與CM的發作。

CM的發病機制尚不完全清楚，但目前三叉神經系統痛覺中樞敏化在CM發病的病理生理機制中占主導地位，而TNC是三叉神經系統痛覺中樞敏化中最重要的解剖結構[6]。NR2B是NMDAR的一個基本調節亞基，在學習、記憶、痛覺傳導及中樞敏化中發揮重要作用，許多神經系統疾病與NR2B也有密切關系[7]，其酪氨酸磷酸化是NR2B激活的一個重要機制[8]。Kato等[9]發現，NR2B-pTyr在中樞痛覺敏化的形成和維持，以及興奮性突觸傳遞和中樞神經系統神經元興奮中毒中發揮關鍵作用。有研究證實，在IS誘發的CM大鼠TNC中，NR2B-pTyr表達水平較對照組大鼠明顯升高。而NR2B-pTyr表達水平的升高，會使鈣離子(Ca2+)滲透性增加，當神經元中Ca2+濃度達到一定水平，并與鈣調蛋白相結合，就會激活神經元的一氧化氮合酶(NOS)，最終引起中樞痛覺過敏和頭痛。另有研究表明，NR2B-pTyr在三叉神經系統的中樞敏化和痛覺傳遞中發揮重要作用。有研究證實，隨著NR2B-pTyr在TNC中表達水平的升高，CM大鼠的痛閾值明顯降低，且隨著AdR-siPTEN抑制PTEN基因的表達，繼而抑制NR2B-pTyr在TNC中的表達，模型組大鼠的痛閾值恢復至與對照組相近的水平[10]。這些結果表明，CM大鼠的痛閾值是降低的，而痛閾值的降低與NR2B-pTyr表達升高相關。

NO是目前公認的在偏頭痛發病機制中起關鍵作用的分子，它可以立即擴張大腦動脈引起非特異性頭痛，又可以作為信號分子傳導痛覺，參與中樞敏化的形成，引起延遲的典型偏頭痛樣頭痛[11]。研究發現，偏頭痛大鼠模型中TNC神經元型一氧化氮合酶(nNOS)活性增強，一方面可以導致內源性NO的釋放大量增加，增加的NO參與TNC中樞敏化，引起痛覺超敏；另一方面它可以通過增加三叉神經節神經元中樞突觸釋放的降鈣素基因相關肽(CGRP)，增加易化痛覺傳遞，從而形成偏頭痛[12-14]。還有研究表明，在偏頭痛患者頭痛發作期，其血清NO水平明顯升高，而在其頭痛間歇期，NO水平降低，但是仍高于正常水平[15]。與上述研究類似，本研究結果表明，在CM大鼠的TNC中，NO水平明顯升高，導致TNC中樞敏化，從而導致偏頭痛大鼠模型的痛閾值降低。

PTEN是定位在第10號染色體的抑癌基因，它不僅可以通過抑制細胞增殖和通過DNA損傷使細胞凋亡來抑制腫瘤形成，還在中樞神經系統相關疾病中發揮重要作用。研究報道，下調PTEN基因可降低NR2B和NR2B-pTyr的表達，阻斷Ca2+內流，增加細胞活力，從而保護神經元損傷；且下調PTEN基因可引起環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)表達增加，從而增強全腦缺血再灌注大鼠的學習記憶能力[15-17]。本研究表明，通過AdR-siPTEN轉染TNC，可以使CM大鼠痛閾值升高，以及行為學恢復到與對照組基本一致的水平，同時，也可使TNC內NR2B-pTyr和NO水平降低。提示PTEN可能通過PTEN/NR2B-pTyr/NO信號通路在CM的發病中發揮重要作用，而PTEN影響TNCNR2B-pTyr水平的分子機制，以及其如何通過PTEN/NR2B-pTyr/NO信號通路發揮作用，目前尚不清楚，有待進一步研究。

[1]MehrotraS，GuptaS，ChanKY，etal．Currentandprospectivepharmacologicaltargetsinrelationtoantimigraineaction[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol，2008，378(4)：371-394.

[2]GrosshansDR，BrowningMD．ProteinkinaseCactivationinducestyrosinephosphorylationoftheNR2AandNR2BsubunitsoftheNMDAreceptor[J]．JNeurochem，2001，76(3)：737-744.

[3]冉麗，申崇標，陳力學，等．下調PTEN基因對偏頭痛大鼠三叉神經節NMDAR1和一氧化氮的影響[J]．中國疼痛醫學雜志，2012，18(3)：163-168．

[4]OshinskyML，GomonchareonsiriS．Episodicduralstimulationinawakerats:amodelforrecurrentheadache[J]．Headache，2007，47(7)：1026-1036．

[5]StuckyNL，GregoryE，WinterMK，etal．SexdifferencesinbehaviorandexpressionofCGRP-relatedgenesinarodentmodelofchronicmigraine[J]．Headache，2011，51(5)：674-692．

[6]PaneraiAE．Ismigraineadisorderofthecentralnervoussystem?[J]．NeurolSci，2013，34(Suppl1)：S33-35.

[7]ZhouQ，ShengM．NMDAreceptorsinnervoussystemdiseases[J]．Neuropharmacology，2013(74)：69-75.

[8]ZhangJ，ZhangW，SunY，etal．ActivationofGRs-Akt-nNOs-NR2BsignalingpathwaybyseconddoseGRagonistcontributestoexacerbatedhyperalgesiainaratmodelofradicularpain[J]．MolBiolRep，2014，41(6)：4053-4061.

[9]KatoH，NaritaM，MiyatakeM，etal．RoleofneuronalNR2Bsubunit-containingNMDAreceptor-mediatedCa2+influxandastrocyticactivationinculturedmousecorticalneuronsandastrocytes[J]．Synapse，2006，59(1)：10-17．

[10]李王文．PTEN介導NR2B-Tyr信號通路參與大鼠偏頭疼慢性化的維持機制[D]．重慶：重慶醫科大學，2014．

[11]BarbantiP，EgeoG，AuriliaC，etal．Drugstargetingnitricoxidesynthaseformigrainetreatment[J]．ExpertOpinInvestigDrugs，2014，23(8)：1141-1148.

[12]BatesEA，NikaiT，BrennanKC，etal．Sumatriptanalleviatesnitroglycerin-inducedmechanicalandthermalallodyniainmice[J]．Cephalalgia，2010，30(2)：170-178.

[13]MarkovicsA，KormosV，GasznerB，etal．Pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptideplaysakeyroleinnitroglycerol-inducedtrigeminovascularactivationinmice[J]．NeurobiolDis，2012，45(1)：633-644.

[14]StorerRJ，SupronsinchaiW，SrikiatkhachornA．Animalmodelsofchronicmigraine[J]．CurrPainHeadacheRep，2015，19(1)：467.

[15]UzarE，EvliyaogluO，ToprakG，etal．Increasedasymmetricdimethylarginineandnitricoxidelevelsinpatientswithmigraine[J]．JHeadachePain，2011，12(2)：239-243.

[16]陳力學，劉寶松，石少權，等．下調PTEN基因對缺氧損傷后海馬神經元NR2B受體調控機制研究[J]．重慶醫科大學學報，2010，35(4)：493-496．

[17]陳力學，姜利人，劉寶松，等．PTEN表達下調對神經元缺氧損傷的保護及其作用機制[J]．第三軍醫大學學報，2006，28(19)：1942-1944．

[18]陳力學，熊新，桂蓓，等．下調PTEN基因對全腦缺血大鼠學習記憶能力和CREB表達的影響[J]．重慶醫科大學學報，2011，36(6)：673-676．

The effects of PTEN gene down-regulation on the NR2B-pTyr expression and NO in rat model of chronic migraine*

LiWangwen1，QinGuangcheng1，ChenLixue1△，XieJingmei1，WuBaixue1，ZhouJiying2

(1.LaboratoryResearchCenter,2.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To employ the RNAi recombinant adenovirus to knock down the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN) gene,and to explore the effects of PTEN gene on the expression of tyrosine phosphorylation of the NR2B subunit and nitric oxide(NO) in the trigeminal nucleus caudalis(TNC) of rats with inflammatory soup-induced chronic migraine.Methods SD rats were divided into the control groups(with or without intervention) and model groups(with or without intervention).The chronic migraine rat model was established by pumping inflammation soup(IS) to the rat dura mater,and injected AdR-siPTEN into the TNC of rat after the last time pumping IS.The behaviors change of migraine rats was observed,and the expression of PTEN,NR2B-pTyr and NO in TNC of migraine rats was detected 7 days after injecting AdR-siPTEN.Results The expression of PTEN gene in TNC of rate model of chronic migraine was down-regulated by the localized injection of AdR-sipTEN.Compared with the model group,behavioral symptoms of IS-induced rats were obviously relieved,and the expression of PTEN,NR2B-pTyr and NO production in TNC of IS-induced rats was significantly decreased,there was statistically significant difference(P<0.05).Conclusion PTEN may play an important role in the pathological mechanism of chronic migraine.Down-regulating PTEN gene expression can relieve IS-induced pain-related behaviors of rats with chronic migraine,which may be related to the decrease of NR2B-pTyr expression and NO production induced by down-regulation of PTEN.

chronic migraine；phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten；NR2B;phosphorylation；nitric oxide

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.001

國家自然科學基金資助項目(81500957；81671093)；重慶市科委基礎與前沿研究計劃項目(cstc2013jjB10009)；重慶市渝中區科技計劃項目(20160107)。 作者簡介：李王文(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事偏頭痛發病機制研究。△

R747.2

A

1671-8348(2016)35-4897-04

2016-06-16

2016-08-06)