ANGPTL4免疫脂質體對急性肺損傷小鼠的治療作用

趙詠梅 王瑞 李新宇 賀志高 桂俊豪張東輝 王曉燕 張峰 張羽 姜鵬

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·論著·

ANGPTL4免疫脂質體對急性肺損傷小鼠的治療作用

趙詠梅1王瑞2李新宇3賀志高3桂俊豪2張東輝4王曉燕3張峰5張羽5姜鵬5

目的探討ANGPTL4免疫脂質體對轉染脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘發的急性肺損傷(acute lung injury, ALI)小鼠，肺損傷的影響。方法采用逆相蒸發法制備ANGPTL4基因表達質粒與抗CD31抗體偶聯的免疫脂質體；LPS誘發急性肺損傷小鼠模型；觀察經ANGPTL4免疫脂質體轉染的急性肺損傷小鼠的肺部炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平和中性粒細胞活化標志物髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)表達的變化，以及小鼠肺組織病理變化和肺血管通透性的改化。結果ANGPTL4免疫脂質體可以有效增加小鼠肺內ANGPTL4的表達；進而降低ALI小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6水平和MPO的表達；降低ALI小鼠肺組織濕干比和肺泡灌洗液蛋白濃度，減輕肺組織病變程度。結論ANGPTL4免疫脂質體能有效減輕 LPS 誘導的ALI小鼠的肺部炎癥損傷反應。

ANGPTL4； 免疫脂質體； 急性肺損傷； 腫瘤壞死因子； 白細胞介素-6； 髓過氧化物酶

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由各種肺內外因素所致的以急性呼吸窘迫、非心源性肺水腫和持續過度的炎癥反應為特點的臨床綜合征[1-2]，是爆發性流感、嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病死亡的主要原因。ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的一個成員，在調節血管發生、脂類代謝、糖類代謝和胰島素敏感性等具有重要作用[3-5]。研究表明, ANGPTL4能顯著抑制血管內皮細胞的增殖、趨化性和血管形成，并且顯著抑制體內血管內皮生長因子誘導的血管生成和血管滲漏[6-7]。

本研究通過制備ANGPTL4基因表達質粒與抗CD31(血管內皮細胞特異性抗原)抗體偶聯的免疫脂質體，并轉染脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘發的ALI小鼠，觀察ANGPTL4在急性肺損傷小鼠肺微血管內皮細胞上的表達變化，評估ANGPTL4對LPS誘導的肺組織損傷的影響，旨在探討其作用和可能機制，為ALI防治提供理論依據和實驗基礎。

材料和方法

一、 實驗材料

健康BALB/c雄性小鼠(8周齡，體重20～25 g，由新疆實驗動物研究中心提供)40只；pcDNA3.1-ANGPTL4重組質粒由本室制備并保存；CD31抗體、ANGPTL4抗體購自美國BD公司； LPS購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素6((interleukin-6, IL-6)酶聯免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)檢測試劑盒購自廣州欣博盛公司；卵磷脂、膽固酵、DSPE-PEG2000購自Avanti公司；薄膜擠出器購自Avestin公司；Sepharose CL-4B購自Phamacis公司。

二、實驗方法

1. 免疫脂質體與抗體的偶聯：制備方法參照相關文獻[8-10]。采用逆相蒸發法，將卵磷脂、膽固酵、DSPE-PEG2000按比例溶于氯仿液中形成油相，旋轉蒸發儀除去有機溶劑，水浴超聲波儀處理5 min，加入質粒DNA在42 ℃水浴和干冰中反復凍融，并連續通過100 nm薄膜擠出器，未包裹入脂質體的質粒用DNaseI和exonucleaseⅢ 37 ℃作用1 h，EDTA終止反應。瓊脂糖CL-4B柱分離包裹質粒DNA的脂質體和被核酸酶降解的DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測。CD31單克隆抗體經修飾硫化后與包裹質粒DNA的脂質體室溫下輕搖連接過夜，再次用瓊脂糖CL-4B柱分離未連接的抗體和免疫脂質體，置4 ℃冰箱備用。

2. LPS誘發ALI小鼠模型及實驗分組: 小鼠實驗前禁食8 h，自由飲水，隨機分為四組，每組10只：①生理鹽水對照組：腹腔注射生理鹽水；②ALI組：以氯胺酮(150 μg/g)腹腔內注射麻醉小鼠，麻醉后環甲膜穿刺于氣管內滴入LPS(3 μg/g)；③干預對照組：在LPS注射前3 d經鼻滴入給予CD31抗體-空載體免疫脂質體轉染；④干預組：在LPS注射前3 d經鼻滴入給予ANGPTL4免疫脂質體轉染。

3. ANGPTL4免疫脂質體對LPS誘導的肺組織損傷影響的觀察: 分別于氣管內滴入LPS后6 h眥靜脈放血處死小鼠，收集血清用于TNF-α、IL-6的ELISA檢測；結扎右肺，左肺行肺泡灌洗，釆用BCA法測定肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白含量。4%多聚甲醛固定右肺上葉，常規石蠟包埋、切片，用于HE染色和免疫組織化學檢測。右肺下葉行肺干濕比測定衡量肺水腫情況。右肺其它部分放于-70 ℃保存，提取RNA和蛋白，采用熒光定量反轉錄PCR和Western-blot法檢測ANGPTL4和MPO的表達。相關引物序列(其中ALB和FOXP2作為內參基因)，見表1。

表1 相關引物序列

三、統計學方法

結 果

一、ANGPTL4免疫脂質體對小鼠肺組織 ANGPTL4表達的影響

我們采用熒光定量反轉錄PCR(RT-PCR)和Western blot 方法檢測了小鼠肺內 ANGPTL4的表達水平，結果顯示，與生理鹽水對照組相比，LPS組小鼠肺內ANGPTL4的表達顯著增加(P<0.05)；與干預對照組相比，干預組小鼠肺內ANGPTL4的表達顯著增加(P<0.05)；而LPS組和干預對照組小鼠肺內ANGPTL4的表達則無顯著性差異(P>0.05)，見圖 1。

圖1 ANGPTL4免疫脂質體對小鼠肺組織 ANGPTL4表達的影響；注：A：RT-PCR 檢測各處理組小鼠肺組織中 ANGPTL4基因的表達；B：Western blot檢測各處理組小鼠肺組織中 ANGPTL4蛋白的表達

二、肺部炎癥因子TNF-α、IL-6水平和中性粒細胞活化標志物MPO表達的變化情況

采用ELISA方法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α 、 IL-6水平，用RT-PCR的方法檢測肺泡灌洗液中中性粒細胞活化標志物髓過氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO)的表達情況，結果顯示，與生理鹽水對照組相比，LPS組小鼠肺泡灌洗液中MPO的表達顯著增高(P<0.05)；與干預對照組相比，干預組小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6水平和MPO的表達則顯著降低了(P<0.05)；LPS組和干預對照組的TNF-α、IL-6水平和MPO的表達之間則無顯著性差異(P>0.05)，見圖 2。

三、小鼠肺組織病理變化和肺血管通透性的變化情況

肺組織切片 HE 染色結果顯示，相比生理鹽水對照組，LPS組和干預對照組小鼠在LPS腹腔注射6 h后肺組織都可見中性粒細胞大量浸潤、肺泡結構破壞以及肺泡間隔增厚，表現為典型急性肺損傷；而干預組小鼠的肺組織病變程度較 LPS組和干預對照組明顯減輕，見圖3-A。

肺血管通透性增加是內毒素性急性肺損傷的典型特征，為進一步明確 ANGPTL4-免疫脂質體對 LPS誘導的肺血管通透性的影響，我們又對肺組織濕干比和肺泡灌洗液蛋白濃度進行了檢測，結果顯示，LPS 組小鼠的肺組織濕干比較生理鹽水對照組明顯增加(P<0.05)；干預組小鼠的肺組織濕干比較干預對照組明顯降低(P<0.05)；而干預對照組與LPS組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖3-B。肺泡灌洗液中蛋白濃度結果與肺組織濕干比結果相一致，與 LPS 組及干預對照組相比，干預組小鼠的肺泡灌洗液蛋白濃度明顯降低(P<0.05)，見圖 3-C。

圖2 ANGPTL4免疫脂質體對炎癥因子TNFα、IL6的分泌及中性粒細胞活化標志物MPO表達的影響；注：A：ELISA檢測各處理組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α的水平；B：ELISA檢測各處理組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6水平；C：RT-PCR檢測各處理組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞活化標志物 MPO的表達

圖3 ANGPTL4免疫脂質體小鼠肺組織病理、肺組織濕干比和肺泡灌洗液蛋白濃度的影響；注：A：各處理組小鼠肺組織切片HE染色結果；B：各處理組小鼠肺組織濕干比；C：BCA法檢測各處理組小鼠肺泡灌洗液中蛋白濃度

討 論

盡管氣道護理和保護性機械通氣取得了一定的進步，但ALI的發病機制尚不完全明確，臨床上還不能完全做到降低其死亡率。ALI以肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷為主要表現，而肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞構成的肺泡毛細血管屏障即血氣屏障對于肺臟氣體交換、防止血液中物質返流入間質和進入肺泡腔等至關重要，肺微血管內皮細胞通透性增加、血氣屏障完整性破壞導致的高通透性肺水腫是ALI的基本病理表現[11]。因此針對高通透性肺水腫，尋找新的肺泡毛細血管通透性的調劑因子進而恢復肺微血管內皮細胞通透性，可能是防治ALI/ARDS，降低其死亡率的有效途徑。

細胞因子和炎癥介質在ALI中具有重要作用，但由于細胞因子的種類繁多，其調控網絡極其復雜，此時僅作用于單一位點的治療很難獲得理想效果。如能逆轉ALI的基本病理特征——高通透性肺水腫，可能會降低ALI的死亡率。ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的一個成員，在肺、腎、肝臟、垂體、骨骼肌和心臟中均有表達[12-13]。ANGPTL4基因具有多種作用，但其最重要的作用是調節血管發生、脂類代謝、糖類代謝和胰島素敏感性等[3-5]。血管發生既是機體生長發育的正常生理過程，又是腫瘤、心血管疾病和各種炎性反應的重要病理基礎。近期的研究表明：ANGPTL4能顯著抑制血管內皮細胞的增殖、趨化性和血管形成，并且顯著抑制體內血管內皮生長因子誘導的血管生成和血管滲漏[6-7]。因此，闡明ANGPTL4與血管發生的關系，對于全面認識血管發生的分子機制，了解和防治腫瘤、各種炎癥反應等與血管發生相關的人類疾病具有重要意義。

上調基因在動物體內的表達多是通過腺病毒、慢病毒等病毒載體，但是上述病毒載體缺乏血管靶向性，如直接注射ANGPTL4重組腺病毒至ALI動物，會對其他組織的血管產生影響；而血管局部的基因轉染亦有其局限性。而免疫脂質體是將特異性抗體粘附于脂質體上，它通過特異性識別表達具有某種抗原的細胞或組織，具有靶向性強、半衰期長等優點[14]，已有應用免疫脂質體成功的靶向轉染基因至內皮細胞的報道[15-16]。

本研究通過制備ANGPTL4基因與可以靶向識別血管內皮細胞的抗CD31抗體偶聯的免疫脂質體，并轉染LPS誘發ALI小鼠，結果顯示，轉染后的小鼠肺組織 ANGPTL4表達水平明顯增高，表明我們構建的ANGPTL4-免疫脂質體轉染是有效的。在此基礎上，我們繼續觀察評估ANGPTL4對對LPS誘導的肺組織損傷的影響，結果顯示LPS誘導小鼠非損傷后，ANGPTL4表達水平出現應激性上調，繼續上調ANGPTL4在小鼠肺內的表達，能夠減輕 LPS 誘導的急性肺損傷小鼠肺組織中性粒細胞浸潤、減少炎癥因子TNF-α 和IL-6的表達，降低肺組織濕干比和肺泡灌洗液蛋白濃度，抑制MPO 的表達。以上結果均提示ANGPTL4-免疫脂質體能有效能夠減輕 LPS 誘導的ALI小鼠的肺部炎癥損傷反應，因此我們推測ANGPTL4可能是炎癥反應的保護性蛋白，ANGPTL4的高表達后影響炎癥因子的信號通路如PKC[17]、ERK-MAPK[18]通路等，減少炎癥因子的釋放，同時維持內皮細胞的穩定性，保護肺損傷，防止炎癥因子的滲出[17-18]。我們將在以后的研究中進一步深入探討其機制，為肺損傷的早期治療提供更多的理論基礎和策略。

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(本文編輯：王亞南)

趙詠梅，王瑞，李新宇，等. ANGPTL4免疫脂質體對急性肺損傷小鼠的治療作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 507-511.

JiangPeng,Email：jipzym@126.com

Objective To investigate the effects of immunoliposomes containing ANGPTL4 on acute lung injury in mice. Methods Liposomes containing ANGPTL4 plasmids were prepared by reverse phase evaporation technique and then combined with CD31 antibody to form the immunoliposomes. Results The results demonstrated that the ANGPTL4 immunoliposome could markedly increase the expression of ANGPTL4 in the lung of ALI mice, decrease the secretion of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(IL-6), and the expression of myeloperoxidase(MPO) in bronchoalveolar lavage fluid of ALI mice. The lung wet dry weight, protein concentration ratio in alveolar lavage fluid were also deceased in ALI mice after ANGPTL4 immunoliposome transferred, hints that ANGPTL4 immunoliposome could reduce the degree of lung lesions, as shown in the results of HE-staining. Conclusion ANGPTL4 immunoliposome has the protective effects on lung injury.

ANGPTL4; Immunoliposome; Acute lung injury; Tumor necrosis factor-α; Interleukin-6; Myeloperoxidase

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.008

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2013211A062)

830000 烏魯木齊，新疆醫科大學·新疆軍區總醫院血液科1、 臨床醫學研究所2、 急診與危重癥科3、 實驗動物科4、呼吸內科5

姜鵬，Email：jipzym@126.com

R563

A

2016-08-01)

Effects of immunoliposomes containing ANGPTL4 on acute lung injury in miceZhaoYongmei1,WangRui2,LiXinyu3,HeZhigao3,GuiJunhao2,ZhangDonghui4,WangXiaoyan3,ZhangFeng5,ZhangYu5,JiangPeng5.DepartmentofHematology1;Instituteofclinicalmedicine2;DepartmentofEmergencyandCriticalCareMedicine3;DepartmentofLaboratoryAnimalScience4;DepartmentofRespiratory5,XinjiangMedicalUniversity·XinjiangMedicalUniversity,MilitaryGeneralHospitalinXinjiangofPeople′sLiberationArmy,Urumchi830000,China