胰島素樣生長因子-1在油酸致急性肺損傷小鼠中的作用

劉峰 黃華萍 李羲 陳明凈 劉美花

?

· 論著·

胰島素樣生長因子-1在油酸致急性肺損傷小鼠中的作用

劉峰1黃華萍1李羲1陳明凈2劉美花1

目的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在油酸致急性肺損傷小鼠模型中的變化規(guī)律，及在急性肺損傷中的作用。 方法通過小鼠尾靜脈注射油酸(0.3 ml/kg)建立急性肺損傷小鼠模型，8 h斷頸法處死小鼠，進行肺濕/干重(W/D)比值的測定和蘇木精-伊紅(HE)染色，判斷造模的效果。健康BALB/c小鼠60只，隨機分為油酸組(35只)和對照組(25只)。油酸組從尾靜脈注入0.3 ml/kg的油酸, 對照組從尾靜脈注入同等體積的生理鹽水。兩組分別于1、3、7、14、21、28 d觀察小鼠的中毒表現(xiàn)，并各處死3只小鼠取左肺進行HE和Masson染色觀察肺組織的病理改變，同時眼眶采血測定血清IGF-1含量。結果油酸注入后10 mins～1 h小鼠開始出現(xiàn)呼吸困難，8 h時檢測肺濕/干重比明顯增加，肺組織病理表現(xiàn)為肺泡及肺間質大量中性粒細胞浸潤，肺泡隔增厚，肺間質水腫，肺泡腔內充滿水腫液，肺內小血管及肺泡隔毛細血管擴張充血明顯，部分肺泡出血。各時段油酸組IGF-1水平增加，第7天出現(xiàn)急劇地升高，然后趨向平緩，較對照組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。油酸組小鼠第1～3天病理特征為明顯肺泡炎改變；第7～21天肺泡炎癥改變減輕，纖維增生明顯，支氣管周圍、肺泡間隔及肺泡腔內出現(xiàn)纖維化；第28天纖維增生趨向于平緩。結論油酸致急性肺損傷小鼠細胞因子IGF-1水平隨時間遞增，其變化趨勢與組織病理的纖維化進程一致，提示IGF-1在 ARDS的發(fā)病過程中可能起到了重要的作用，并可促進其纖維增生的進程。

急性肺損傷； 胰島素樣生長因子-1； 油酸； 肺纖維化

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指各種肺內和肺外致病因素所導致的急性彌漫性肺損傷和進而發(fā)展的急性呼吸衰竭。急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和ARDS為同一疾病過程的兩個階段。失控性的炎癥反應是ARDS發(fā)生、發(fā)展的關鍵性因素[1]。致病因子通過激活多種炎癥細胞，釋放一系列炎癥介質，這些炎癥介質可再度激活炎癥細胞，以“自分泌”或“旁分泌”的方式釋放更多的炎癥介質，導致瀑布式的炎癥反應，從而導致肺的過度損傷[2]。

早期的研究顯示，中性粒細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞均等可分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)，白細胞介素-1 (interleukin-1,IL-1)，IL-6，IL-10，胰島素樣生長因子-I(insulinlike growth factors-I, IGF-I)，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等炎癥介質，它們表達的種類、作用濃度和高表達的時間差異以及其相應受體激活程度，對啟動ARDS早期炎癥反應、維持炎癥反應并促進ARDS纖維化進程起重要作用[3]，其中IGF-I是人們關注的熱點之一[4-7]。本研究擬通過給小鼠尾靜脈注射油酸建立急性肺損傷小鼠模型，觀察油酸注入后不同時間點小鼠靜脈血IGF-I的動態(tài)變化，同時取小鼠肺組織進行組織病理學檢查，比對IGF-I水平與肺組織病理肺泡炎和肺纖維化的變化，探討IGF-I與ARDS發(fā)生發(fā)展的關系。

材料與方法

一、實驗材料

1. 實驗動物: SPF級健康BALB/c小鼠，體重 20 g～25 g，6～8周齡，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

2. 實驗試劑: 油酸購自上海源葉生物科技有限公司。鼠IGF-1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

二、實驗方法

1. 模型制備：健康BALB/c小鼠4只，雌雄不拘。采用俯臥位，從小鼠尾靜脈注射油酸(0.3 ml/kg)，8 h后斷頸法處死小鼠，剪下整個肺臟，右肺用于肺濕/干重(W/D)比值的測定，左肺用4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅(HE)染色，根據(jù)光學顯微鏡下組織病理學特點判斷油酸致急性肺損傷小鼠模型造模成功。

2. 動物分組：健康BALB/c小鼠60只，雌雄不拘，適應性飼養(yǎng)1周，實驗前禁食禁飲12 h。按照隨機數(shù)字表示法分為油酸組(35只)和對照組(25只)。油酸組從尾靜脈注入0.3 ml/kg的油酸, 對照組從尾靜脈注入同等體積的生理鹽水。兩組分別于1、3、7、14、21、28 d各處死3只小鼠，然后剩下的小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至實驗結束。眼眶采血3 ml，留取血清，用于測定IGF-1含量。采血完畢后斷頸法處死小鼠，剪下整個肺臟，左肺用于病理學觀察。

3. 動物觀察：每日觀察小鼠的呼吸頻率、呼吸費力、鼻翼煽動、嘴唇、顏面和粘膜紫紺的變化，記錄死亡的情況。

4. 肺濕/干重(W/D)比值：油酸注入8 h后斷頸法處死小鼠,進行肺濕重與干重比值的測定。方法：取右肺，迅速用吸水紙吸干表面水分和血液,電子天平精確稱濕質量，然后置于70 ℃烘箱內烘烤72 h至恒重,再稱干質量。

5.血清IGF-1水平的ELISA檢測： 采用ELISA法，測定IGF-1的含量(按照試劑盒中的說明書進行)。

6.肺組織病理學檢查：取小鼠左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，行HE及Masson 染色，在光學顯微鏡下對肺泡、間質炎癥性改變、出血、肺不張、肺水腫及間質纖維化分別進行評價。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、小鼠中毒表現(xiàn)和死亡統(tǒng)計

對照組小鼠無異常表現(xiàn)。油酸組小鼠油酸注入后10 mins～1 h即開始出現(xiàn)呼吸困難，表現(xiàn)為煩躁、呼吸費力、頻率加快、張口呼吸、口周及顏面紫紺；死亡前表現(xiàn)為毛蓬松、全身發(fā)紺、點頭樣呼吸或深大呼吸。呼吸困難第1～3 d 最為明顯，第8天開始減輕，第21天再次出現(xiàn)加重，第28天后又逐步減輕。

對照組小鼠食欲好，體重較前增加，喜活動，毛發(fā)有光澤，飼養(yǎng)至28 d無自然死亡；油酸組小鼠油酸注入后至28天共死亡4只，分別發(fā)生于：第1 d死亡2只，第2～7天死亡1只，第8～20天死亡0只，第21～28天死亡1只。

二、肺濕/干重比值

肺濕/干重比值健康組3.565±0.044，油酸組5.285±0.053(t=49.652，P=0.000)。

三、血清IGF-1水平

油酸組小鼠油酸注入后IGF-1水平呈持續(xù)上升趨勢，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，見表1。IGF-1水平在油酸注入后第7天出現(xiàn)急劇地升高，然后趨向平緩。油酸組不同時間點比較，IGF-1水平第14天較第7天有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.157)；第21天較第7天有升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)；第28天較較第21天有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.249)。

注：P值為組間比較

四、肺組織病理改變

肺組織HE染色示，對照組小鼠肺組織結構正常。油酸組小鼠第1～3天出現(xiàn)肺泡炎性細胞浸潤，肺泡上皮增生，肺泡間隔增寬，血管充血明顯，肺泡腔內充滿水腫液、部分肺泡出血；第7天后炎癥減輕，組織增生明顯，Masson 染色可見成纖維細胞增殖，藍綠色膠原纖維首先出現(xiàn)支氣管周圍、肺泡間隔，接著出現(xiàn)于肺泡內。第28天纖維增生趨向平緩。

討 論

本研究通過小鼠尾靜脈注射油酸，制備急性肺損傷小鼠模型，在油酸肺損傷小鼠模型建立后8 h即肺損傷早期，觀察小鼠的中毒表現(xiàn)、肺濕/干重比以及肺組織病理切片的指標變化。發(fā)現(xiàn)靜脈注射油酸后10 min～1 h小鼠開始出現(xiàn)呼吸困難的表現(xiàn)；8 h時肺濕/干重比明顯增加；肺組織病理切片主要的病理改變?yōu)椋悍闻菁胺伍g質大量中性粒細胞浸潤，肺泡隔增厚，肺間質水腫，肺泡腔內充滿水腫液，部分肺泡出血，肺內小血管及肺泡隔毛細血管擴張充血明顯。提示本研究成功復制了油酸致小鼠急性肺損傷模型。

本研究結果顯示，在油酸致小鼠急性肺損傷發(fā)病過程中，IGF-1水平存在規(guī)律性的變化。油酸注入后，當天開始出現(xiàn)血清IGF-1水平升高，第7天出現(xiàn)急劇地增高，第14天后雖仍保持上升的勢頭，但趨向平緩，見圖1，第21天較第14天以及第28天較第21天有升高，但差異無統(tǒng)計學意義。黃敏等[8]研究結果顯示，百草枯中毒急性肺損傷大鼠染毒后第3～56 d 血清IGF-1含量逐漸升高，且一直維持在較高水平，它隨時間動態(tài)變化，第3 d血清IGF-1 含量開始升高，第7～14 d強度急劇增強，第28～56 d繼續(xù)增強，增強幅度較小。菅向東等[9]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯染毒大鼠于染毒后8 h、24 h、72 h 血清中IGF-l 水平顯著升高，并隨染毒濃度的增加而增加。上述研究結果顯示，IGF-1可能參與了 ARDS的發(fā)病過程，其動態(tài)演變在急性肺損傷發(fā)病機制中可能起到了重要的作用。

本研究結果顯示，油酸組小鼠第1～3天表現(xiàn)為明顯肺泡炎改變，肺泡及肺間質大量中性粒細胞及少量的巨噬細胞浸潤，肺泡隔增厚，血管充血明顯，肺泡腔內充滿水腫液、出血；第7～21天肺泡炎癥改變減輕，纖維增生明顯，支氣管周圍、肺泡間隔及肺泡腔內逐步出現(xiàn)纖維化。第28天纖維增生趨向于平緩。有研究顯示，百草枯染毒組大鼠第1～7 d出現(xiàn)明顯肺泡炎改變，第14～56 d炎性改變減輕，組織增生明顯，并隨時間呈進行性加重，病變嚴重處可見纖維瘢痕樣組織，肺泡萎陷或消失[8]。隋宏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯染毒組大鼠7天以后可見到肺泡腔內纖維化，2周后明顯，再以后肺泡腔內滲出物的纖維化、肺泡及肺泡管透明膜的機化、肺泡隔纖維化呈進行性進展。研究顯示，百草枯致急性肺損傷較本組油酸致急性肺損傷，纖維增殖期更顯著，病死率更高(百草枯染毒組病死率vs. 油酸染毒組病死率：30.4%vs. 10.4%)，這與臨床觀察到的不同病因誘發(fā)的ARDS結局預后存在不同相符合。

IGF-1被認為是肺泡巨噬細胞衍生的生長因子，能刺激肺成纖維細胞進入G1期，促進肺成纖維細胞增殖，抑制肺成纖維細胞的凋亡[11]，而且還能作為一種促進因子增強其它與纖維增生有關的細胞因子如TGF-β1、CTGF、PDGF 等的作用，與肺纖維化疾病的進展有關[12-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，油酸致急性肺損傷過程中血清IGF-1的變化趨勢與組織病理顯示的纖維化進程呈一致性，提示IGF-1可能參與了 ARDS的發(fā)病過程，并可能促進了ARDS發(fā)生纖維化增生的進程，然而其作用的具體機制尚有待于進一步的探討。

綜上所述，油酸所致小鼠肺損傷后的急性反應過程和肺部的病理改變與臨床相似，因此，油酸可成功復制小鼠急性肺損傷模型。為了驗證IGF-1與FP-ARDS的關系，下一步將利用單克隆抗體阻斷IGF-1R，并進行細胞增殖、凋亡、遷移的測定，觀察其能否延緩或阻斷ARDS的纖維化進程。

1 暢毅平, 彭鵬. 炎癥細胞因子與急性呼吸窘迫綜合征的研究進展[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(2): 315-318.

2 李玉梅, 衛(wèi)洪昌. ALI/ARDS抗炎治療研究的策略與展望[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(4): 813-816.

3 張華. 急性百草枯中毒早期臟器損傷與細胞因子變化規(guī)律的研究[D]. 山東大學, 2007：23-30.

4 Kim TH, Chow YH, Gill SE, et al. Effect of insulin-like growth factor blockade on hyperoxia-induced lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012, 47(3): 372-378.

5 Schnapp LM, Donohoe S, Chen J, et al. Mining the acute respiratory distress syndrome proteome: identification of the insulin-like growth factor (IGF)/IGF-binding protein-3 pathway in acute lung injury[J]. Am J Pathol, 2006, 169(1): 86-95.

6 Ahasic AM, Tejera P, Wei Y, et al. Predictors of circulating insulin- like growth factor-1 and insulin-like growth factor-binding protein-3 in critical illness[J]. Crit Care Med, 2015, 43(12): 2651-2659.

7 Xiangdong J, Ming L, Yijing Z, et al. Role of growth factors in acute lung injury induced by paraquat in a rat model[J]. Hum Exp Toxicol, 2011, 30(6): 460-469.

8 黃敏, 楊惠芳, 李宏輝, 等. 百草枯中毒致肺纖維化大鼠細胞因子表達及四氫吡咯二硫代氨基甲酸酯的干預作用[J]. 中國呼吸與危重監(jiān)護雜志, 2012, 11(5): 452-458.

9 菅向東, 隋宏, 張玲, 等. 轉化生長因子-β1 PDGF胰島素樣生長因子-1在急性百草枯中毒動物模型中的動態(tài)變化[C]. 北京: 2007.

10 隋宏. 急性百草枯中毒致肺損傷肺纖維化機制的實驗研究[D]. 山東大學, 2007：28.

11 陳非, 鄧鴻業(yè), 龍振洲. 肺泡巨噬細胞因子與肺纖維母細胞[J]. 國外醫(yī)學(免疫學分冊), 1991, (2): 82-85.

12 Daian T, Ohtsuru A, Rogounovitch T, et al. Insulin-like growth factor-I enhances transforming growth factor-beta-induced extracellular matrix protein production through the P38/activating transcription factor-2 signaling pathway in keloid fibroblasts[J]. J Invest Dermatol, 2003, 120(6): 956-962.

13 Andonegui G, Krein PM, Mowat C, et al. Enhanced production of IGF-I in the lungs of fibroproliferative ARDS patients[J]. Physiol Rep, 2014, 2(11)：e12197.

14 Krein PM, Sabatini PJ, Tinmouth W, et al. Localization of insulin-like growth factor-i in lung tissues of patients with fibroproliferative acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2003, 167(1): 83-90.

15 Marshall RP, Bellingan G, Webb S, et al. Fibroproliferation occurs early in the acute respiratory distress syndrome and impacts on outcome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 162(5): 1783-1788.

16 Madtes DK, Rubenfeld G, Klima LD, et al. Elevated transforming growth factor-alpha levels in bronchoalveolar lavage fluid of patients with acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 158(2): 424-430.

17 Krein PM, Sabatini PJ, Tinmouth W, et al. Localization of insulin-like growth factor-I in lung tissues of patients with fibroproliferative acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2003, 167(1): 83-90.

18 鄭慧新, 李春花, 任成山. 百草枯中毒致急性肺損傷發(fā)病機制研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2014, 7(5): 567-570.

(本文編輯：黃紅稷)

劉峰，黃華萍，李羲，等. 胰島素樣生長因子-1在油酸致急性肺損傷小鼠中的作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 503-506.

Huanghuaping,Email:our803@sina.com

Objective To observe the variation of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) with time and investigate its role in acute lung injury(ALI) induced by oleic acid in a rat model. Methods The mice were injected with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously to induce ALI. The wet/dry weight (W/D) of the right lung were examined and sections of left lung were stained with hematoxylin eosin to estimate the effect in rat model of ALI at 8 hours later after oleic acid treatment. Sixty BALB/c mice were randomly divided into an oleic acid group (n=35) and a control group (n=25). The oleic acid group was treated with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously and the control group was treated with same amount of normal saline. 3 rats in each group respectively were sacrificed on 1 st, 3 rd, 7 th, 14 th, 21 th and 28 th day after the treatment. Pathological changes were observed in sections of left lung stained with hematoxylin eosin and Masson, meanwhile, the levels of IGF-1 in serum were measured. Results The mice began to have difficulty breathing after 10 mins-1 h with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously. After 8h with oleic acid treatment, the W/D was much higher in the oleic acid group than that in the control group. Moreover, the characteristics of the lung pathologic histology were the infiltration of a large number of neutrophils in the alveoli and interstitial tissue, thickening of alveolar septa, alveolar and interstitial pulmonary edema, congestion, diffuse dilation of pulmonary capillaries and alveolar hemorrhage. The expression of IGF-1 significantly increased in the oleic acid group compared with the control group on different time points (P=0.000). The curve showed there was an obvious increasing tendency on 7th day. The phase in early (1-3 d) was characterized by acute alveolitis. The phase in later stage (7-21 d) was characterized by marked proliferation of fibrous tissue. It would become slower after 28 th day. Conclusions The expression of IGF-1 is increased with the time which is consistent with the progression of pulmonary fibrosis in the comparison of the lung histopathological examination in acute lung injury induced by oleic acid in a rat model.

Acute lung injury; Insulin-like growth factor-1; Oleic acid; Pulmonary fibrosis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.007

海南省自然科學基金資助項目(811216)

570102 海口，海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內科 海南醫(yī)學院呼吸病研究所1570102 海口，海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2

黃華萍，Email: our803@sina.com

R563

A

2016-07-23)

Variation of insulin-like growth factor-1 with time in acute lung injury induced by oleic acid in a rat modelLiuFeng1,HuangHuaping1,LiXi1,ChenMingjing2,LiuMeihua1.1DepartmentofRespiratoryDisease,AffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,RespiratoryDiseaseInstituteofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China;2DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China