外源性一氧化碳對大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡狀況的影響

李運成 賀斌峰 錢桂生 王關嵩

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·論著·

外源性一氧化碳對大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡狀況的影響

李運成1賀斌峰2錢桂生2王關嵩2

目的研究外源性一氧化碳對大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)凋亡狀況的影響，探討低氧肺血管重建的發病機制及防治措施。方法復合膠原酶法培養動脈平滑肌細胞，分別給予常氧、低氧、低氧合并低濃度一氧化碳處理。采用透射電鏡、流式細胞儀、逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、免疫組織化學染色等方法檢測肺動脈平滑肌細胞的凋亡狀況及caspase-3表達水平。結果電鏡觀察可見，低濃度一氧化碳處理PASMC后呈凋亡樣改變，染色質濃縮成塊狀位于核周邊，細胞核邊集近似半月型，細胞器結構完整。流式細胞儀示，正常培養PASMC沒有明顯的亞二倍峰，低氧24 h條件下可見亞二倍峰，低濃度一氧化碳處理24 h后，PASMC亞二倍峰明顯升高。RT-PCR和免疫組織化可見，低濃度一氧化碳作用后caspase-3的mRNA和蛋白水平顯著升高。結論低濃度一氧化碳可以調節caspase-3基因的表達，從而促進肺動平滑肌細胞的凋亡。

低氧性肺動脈高壓； 一氧化碳； 平滑肌細胞； Caspase-3

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是一種臨床常見病癥，病因復雜，可由多種心、肺或肺血管疾病引起。肺血管重建被認為是低氧肺動脈高壓的主要病理變化[1]，主要表現為動脈中膜肌層增厚 ,平滑肌細胞由收縮型變為合成型，肥大增殖。在上述病理過程中，平滑肌細胞凋亡減少而增殖增加[2]。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)是肺血管壁的主要組成部分，增加平滑肌細胞凋亡可以逆轉肺動脈高壓肺血管重建[3]。caspase-3在細胞凋亡調控中居中心地位，在凋亡發生過程中發揮重要作用。一氧化碳(carbon monoxide, CO)是一類新的信使分子和血管舒張因子，作用與一氧化氮(nitro oxide, NO)有相似之處。以往體外研究發現，低氧可以促進PASMC的增殖，而低濃度CO可以部分抑制低氧對PASMC的作用[4]。為深入探討其機制，本研究利用復合膠原酶法培養肺動脈平滑肌細胞，分別為給予常氧、低氧、低氧合并低濃度CO處理，觀察PASMC的凋亡狀況和caspase-3基因的變化，探討HPH發病機制，為其防治提供新的思路。

材料與方法

一、PASMC的培養和處理

采用復合膠原酶法培養PASMC，參照文獻[5]方法進行。參照文獻[6]方法，應用低濃度CO和低氧氣體處理PASMC 24 h，另取正常細胞作對照。即分為正常組、低氧24 h組、低氧合并低濃度CO 24 h組。

二、超微結構觀察

將低濃度CO和低氧處理的細胞離心成團，用戊二醛固定，4 ℃保存后送電鏡室，再用環氧樹脂包埋，制成超薄切片，于透射電鏡下觀察。

三、流式細胞儀檢查

分組培養24 h 后，離心收集實驗組及空白對照組細胞，按照AnnexinV-FICT試劑盒說明書處理待檢細胞，然后上流式細胞儀進行檢測。

四、逆轉錄聚合酶鏈式反應

上游引物5′-ATG GAC AAC AAC GAA ACC TCC GTG-3′下游引物5′-CCA CTC CCA GTC ATT CCT TTA GTG-3′，擴增目的片段為854 bp。陽性對照為 HPRT，上游引物5′- GCT GGT GAA AAG GAC CTC TCG- 3′，下游引物5′-GCA GAT GGC CAC AGG ACT AGA-3′，擴增的目的片段長度為258 bp。95 ℃ 4 min后加入Taq DNA聚合酶而后94 ℃ 50 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 35個循環，未次延伸時間72 ℃ 10 min。最后用10 μl PCR產物進行電泳、攝像、存入計算機，并用復旦四星的 SX-IMAGE圖像分析系統進行光密度掃描。結果以caspase-3/HPRT的積分光密度比值表示。

五、免疫組織化學染色

Caspase-3一抗為兔抗鼠單克隆抗體，購自加德國寶靈曼公司，工作濃度1︰200；生物素標記的二抗為羊抗兔多克隆抗體，購自武漢博士德公司，工作濃度1︰200。具體方法參見[4]。結果判定:背景無顏色,胞漿內著棕黃色顆粒為陽性細胞。無陽性信號(-)；弱陽性(+), 陽性細胞<25%；弱陽性 (++)，陽性細胞25%～50%；強陽性(+++)，陽性細胞50%～75%；強陽性(++++)，陽性細胞>75%。

六、統計學方法

結 果

一、電鏡觀察結果

電鏡下可見，低氧處理PASMC后有凋亡樣改變；低濃度CO處理PASMC后凋亡樣改變明顯，染色質濃縮成塊狀位于核周邊，即細胞核邊集近似半月型，細胞器結構完整。

二、流式細胞儀檢查結果

正常培養PASMC沒有明顯的亞二倍峰，凋亡率約3.0%；低氧24 h條件下可見亞二倍峰，凋亡率約10%；低濃度CO處理24 h后，PASMC亞二倍峰明顯升高，凋亡率54%，見圖1。

圖1 流式細胞儀檢查結果；注：A：常氧組；B：低氧組；C：CO組流式圖

三、RT-PCR結果

逆轉錄聚合酶鏈式反應顯示，caspase-3在常氧情況下有微量表達，低氧情況下表達升高，低濃度CO作用后顯著升高見，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測caspase-3 mRNA表達情況；注：A：常氧組；B、C：低氧組；D：低濃度CO組

四、免疫組織化學染色結果

正常組PASMC caspase-3免疫組織化學染色很弱，陽性細胞約10%；低氧組caspase-3有所升高，陽性細胞約38.7%；CO組明顯升高，陽性細胞約85.7%，與低氧組比較有顯著差異(P<0.01)。

討 論

近年來，隨著細胞凋亡在肺動脈高壓研究中的不斷深人，人們已經注意到肺動脈高壓時，肺組織細胞可以細胞凋亡方式出現，并在發病中起到一定作用。我們電鏡觀察發現，低濃度CO和低氧處理后，PASMC出現凋亡樣改變，流式細胞儀也證實，低濃度CO處理后，PASMC凋亡率顯著上升。實際上細胞凋亡可以發生于機體內很多正常組織，在增生緩慢的細胞群如前列腺和腎上腺皮質細胞等，以及在增長迅速的細胞群如小腸上皮細胞等，都出現凋亡現象。一方面，血管平滑肌細胞凋亡可能參與調節正常血管壁及新生內膜的形成。另一方面，在原發性高血壓、動脈粥樣硬化及冠狀動脈成形術后再狹窄等疾病中，整體上血管平滑肌細胞表現為增殖活躍，但凋亡也隨之明顯增加[7]。傳統認為凋亡細胞可見凋亡小體，我們的多次選送電鏡標本少見典型的變化。

細胞凋亡是調節機體組織平衡的重要機制，其過程受到嚴密的控制，而caspase(cysteinylaspartate specific proteinase)蛋白酶家族在細胞凋亡發生過程中的個階段都發揮重要作用，caspase是指一群含有半胱氨酸的蛋白酶，目前研究發現至少有14種caspase家族成員，其中caspase-3是最重要成員，引起細胞凋亡的最下游成分，是細胞凋亡的效應分子。caspase引起細胞凋亡的途徑通常為死亡受體接受死亡信號，引起上游procaspase-8的激活，導致caspase-9激活，最終導致caspase-3激活。caspase-3通過破壞細胞核纖層，直接導致細胞結構的破壞，使細胞凋亡。目前對于caspase-3在肺動脈平滑肌細胞中的表達特點及臨床意義尚不十分清楚。我們應用RT-PCR發現，低氧處理后PASMC的caspase-3 mRNA表達水平升高，低濃度CO處理后的caspase-3 mRNA表達水平顯著升高。免疫組化可見兩種情況下，PASMC蛋白質含量均增加，后者增加更顯著。caspase-3是凋亡早期表達的基因，靈敏性高，檢測其表達狀態具有重要意義。

多年來，CO被認為是一種可以致命的毒性氣體。1968年人們已認識到機體可以產生內源性的CO，血紅素氧合酶是內源性CO產生的限速酶。上個世紀九十年代，隨著一氧化氮作為一種氣體信使分子的作用被逐漸了解，同為氣體小分子的CO，在體內的生理作用也逐漸得到重視，CO成為繼一氧化氮之后第二種被發現有病理生理作用的氣體信使分子。近年來的研究發現，CO參與了機體內許多的生理和病理生理過程，在機體內發揮了重要的保護作用。但是對組織細胞的保護機制不盡相同，研究報道在內皮細胞中、在內皮細胞中及胰島的β細胞中，CO發揮了抗凋亡作用[8-17]。CO對PASMC是否有促凋亡作用，目前還不清楚。但已經證實，CO能夠抑制低氧誘導的大動脈平滑肌細胞的增殖，從而在血管重建中發揮作用[18]。有研究發現NO供體硝普鈉鹽刺激兔后，可誘導PASMC凋亡，其中caspase-3的活性上升，mRNA水平升高[19]。CO和NO的性質類似，該研究從一個方面證實了我們的結論。

增殖和凋亡現象共存在于低氧肺動脈高壓大鼠的肺血管細胞中，也許某些凋亡基因的異常表達導致了細胞增殖和凋亡的失衡，進而調節了慢性低氧肺血管結構的改建。本實驗提示caspase-3可能參與了肺動脈組織的凋亡，而CO對caspase-3基因有調節作用，caspase-3在PASMC表達程度對于評估肺動脈高壓患者的預后及指導臨床治療有一定意義。

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(本文編輯：張大春)

李運成，賀斌峰，錢桂生，等. 外源性一氧化碳對大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡狀況的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 494-497.

WangGuansong,Email:wanggs2003@hotmail.com

Objective To investigate the influence of low-dose carbon monoxide on the expression of caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells(PASMC), and explore the pathogenesis and prenvention measures of pulmonary vasccular remoding. Methods The PASMCs of rats were cultured in normal O2, hypoxia, combined hypoxia and carbon monoxide condition. Electronmicroscope, flow cytometry, reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunohistochemistrycal methods were used to detect the expression of the caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells. Results In the PASMCs of rats cultured in combined hypoxia and carbon monoxide condition, the typical morphological changes of apoptosis were observed under transmission electronmicroscope, such as chromatin condensation and aggregation at the nuclear periphery, and nuclear fragmentation as well. The flow cytometer showed that typical apoptosis peak appeared in combined hypoxia and carbon monoxide condition, however, it was not obvious in hypoxia and normal O2condition. Caspase-3 mRNA and protein expression were significantly increased in combined hypoxia and carbon monoxide condition compared with those in hypoxia and normal O2condition. Conclusion Low concentration of carbon monoxide can regulate the expression of caspase-3, thereby promoting apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells.

Hypoxic pulmonary hypertension; Carbon monoxide; Smooth muscle cells; Caspase-3

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.005

國家自然科學基金資助項目(81370168) 蚌埠市科技計劃項目[(2004)10]

233000 蚌埠市第一人民醫院呼吸科1400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸內科 研究所2

王關嵩，Email: wanggs2003@hotmail.com

R322.1+2，R329-3，R543.2

A

2015-09-15)

Effects of low-dose carbon monoxide on expression of caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cellsLiYuncheng1,HeBinfeng2,QianGuisheng2,WangGuansong2.1DepartmentofRespiration,FristPeople′sHospitalofBengbu,Bengbu233000,China;2InstituteofRespiratoryDiseases,theSecondAffiliatedHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China