海水干預下人肺泡上皮細胞活性氧及內質網應激水平的變化

李鵬程 李聰聰 魯曦 王博榮 李玉娟 何銘 金發光

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·論著·

海水干預下人肺泡上皮細胞活性氧及內質網應激水平的變化

李鵬程1李聰聰1魯曦1王博榮1李玉娟2何銘3金發光1

目的探討海水對人肺泡上皮細胞中活性氧(ROS)和內質網應激(ER stress)水平的影響。 方法以含不同濃度海水(20%、40%、60%、80%)的培養液刺激人肺泡上皮細胞系A549細胞1 h后更換培養液，3 h后CCK-8法檢測海水對細胞的毒性；以25%濃度海水刺激A549細胞1 h后，不同時間點(2 h、4 h、6 h、8 h)應用CCK-8法檢測海水對細胞的毒性，Western Blotting法檢測內質網應激特異蛋白GRP78蛋白表達情況，DCFH-DA探針檢測細胞內活性氧水平變化情況。 結果以不同濃度海水刺激A549細胞時，細胞活性受抑制程度呈明顯的濃度依賴性，海水處理組與對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)；細胞在受到短暫海水刺激后恢復時，細胞活性依然受到明顯抑制，在4 h抑制最顯著，之后逐漸恢復，2 h、8 h組與0 h組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而4 h、6 h組與0 h組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)；同時細胞內活性氧類(ROS)含量增多，內質網應激相關蛋白GRP78表達量增加，且都在4 h達到峰值。 結論海水干預可抑制人肺泡上皮細胞增殖活性，而內質網應激和活性氧類參與了海水引起的A549細胞損傷過程。

急性肺損傷； 活性氧； 內質網應激； 海水

近年來，海水淹溺案例逐漸增多，引起公眾重視，據保守估計，每年全球約有50萬人死于海水淹溺[1]。海水淹溺患者病情危急，進展迅速，病死率很高。海水淹溺引起的海水吸入性急性肺損傷(seawater drowning-induced acute lung injury, SW-ALI)以及繼發海水吸入性呼吸窘迫綜合征(seawater drowning-induced acute respiratory distress syndrome, SW-ARDS)致傷重、病情進展快，是致死的重要原因[2-4]。研究表明，SW-ALI之所以比淡水淹溺病情重，是因為高滲海水可直接作用于肺泡上皮細胞引起細胞損傷[5]。

材料與方法

一、主要材料

人肺泡上皮細胞來源細胞A549細胞購自第四軍醫大學；細胞增殖毒性檢測試劑盒CCK-8購自七海生物公司；GRP78抗體、β-actin抗體購自abcam公司；蛋白印跡發光液購自Thermo公司；蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒及其他試劑購自碧云天公司。

配方海水按照中國國家海洋局海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaBr 0.083 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L，CaCl21.141 g/L，MgCl22.447 g/L，MgSO43.305 g/L，NaCl 26.518 g/L；滲透壓1 300 mmol/L，pH 8.2，相對密度1.05。用1 640培養液配制分別含0%、20%、40%、60%、80%濃度海水的培養液。

二、研究方法

1. 細胞培養：A549細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基(內含青霉素及鏈霉素各10 000 U/ml)，在5%CO2、37 ℃孵育箱中培養。每隔2～3 d按1︰2比例進行傳代。

2. CCK-8實驗檢測海水刺激對A549細胞的毒性：以每孔約2 000個細胞在96孔板中接種細胞懸液。在孵育箱中孵育過夜，加入不同濃度(0%、20%、40%、60%、80%)的海水處理1 h后更換新的培養液，3 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育2～4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。同時檢測25%海水處理1 h后，不同時間點(2 h、4 h、6 h、8 h)A549細胞活性的恢復情況。

3. Western Blotting法檢測GRP78、CHOP蛋白表達情況：海水處理細胞1 h后更換新的培養液，在不同時間點(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)收集各組細胞，常規裂解提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，樣品蛋白煮5 min，取樣品蛋白30 μg，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉到PVDF膜上，后用5%脫脂奶粉封閉1 h，GRP78抗體(1︰1 000)和β-actin抗體(1︰1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，顯色并用成像系統拍照分析。

4. DCFH-DA檢測ROS變化情況：胰酶消化細胞，吹打成細胞懸液，以1×106個/L的密度接種于培養皿中，孵育過夜，10 mM DCFH-DA按1︰500比例稀釋于無血清RPMI1640培養液中，混勻后各取700 μl加入培養皿中，在孵育箱中避光孵育45 min，PBS洗3次后加入600 μl PBS，用熒光顯微鏡進行熒光檢測，激發波長500 nm，發射波長525 nm。

三、統計學方法

結 果

一、海水刺激對A549細胞有毒性作用

為了研究不同濃度海水刺激對細胞活性的抑制作用，分別用含0%、20%、40%、60%、80%濃度海水的1 640培養液刺激A549細胞1 h，更換培養液3 h后采用CCK-8法檢測海水對A549細胞的毒性作用。結果發現，海水刺激可明顯抑制A549細胞增殖活性，且呈明顯的濃度依賴性。與對照組相比，隨著海水濃度增加，A549細胞增殖活性下降越明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度海水刺激A549細胞1 h后更換培養液3 h，CCK-8測細胞活性;注：*:P<0.05；***:P<0.001

同時，為了研究海水刺激后不同時間細胞的恢復情況，用含25%海水的1 640培養液刺激A549細胞1 h后，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h檢測細胞增殖活性。結果顯示，在一定時間內(4 h內)，隨著海水刺激后恢復時間的延長，A549細胞增殖活性受抑制程度越嚴重。2 h組與0 h組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而4 h、6 h組與0 h組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)；8 h組與0 h組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 海水刺激A549細胞1 h后更換新培養液不同時間CCK-8測細胞活性；注：*:P<0.05；**:P<0.01

二、海水刺激引起A549細胞內ROS水平增加

用含25%海水的培養液刺激A549細胞1 h后更換新培養液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h時間點用熒光DCFH-DA探針檢測A549細胞內ROS水平。結果顯示，對照組(0 h)正常細胞內的ROS水平很低，隨著時間延長，細胞內ROS水平逐漸升高，并在4 h達到最大值，隨后隨著時間延長ROS水平逐漸降低，見圖3。

圖3 海水刺激1 h后更換新培養液不同時間A549細胞內ROS水平的變化

三、海水刺激引起A549細胞產生內質網應激反應(ERS)

Western blotting法檢測內質網應激標志性蛋白GRP78表達情況，結果如圖4所示，與對照組(0 h)相比較，隨海水刺激后恢復時間延長，蛋白GRP78表達量首先增多，4 h組達到峰值，隨后逐漸降低。GRP78蛋白在2 h、4 h、6 h組的相對表達量與對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而8 h組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖4 海水刺激1 h后更換新培養液不同時間A549細胞內GRP78蛋白的表達

圖5 海水刺激1 h后更換新培養液不同時間A549細胞內GRP78蛋白相對表達量；注：*:P<0.05；***:P<0.001

討 論

發生海水淹溺后，海水的高滲透壓是造成急性肺損傷的重要因素，一方面高滲海水進入肺泡后，肺泡與肺部血管之間產生滲透壓差，使大量液體從血管外滲至肺泡內，導致嚴重的肺水腫[11-12]。另一方面，海水的高滲透壓特性也可作為一種直接刺激，對肺上皮細胞微環境及細胞功能產生影響，正是由于海水的特殊理化性質，海水淹溺導致的急性肺損傷往往比淡水淹溺更為嚴重[13]。迄今為止，對海水淹溺性肺損傷的發病機制還不明確，缺乏有效的治療措施，因此，研究高滲海水如何作用于肺上皮細胞，引起肺損傷的獨特機制，進而尋求更加有效針對的救治方案具有重要意義。

研究表明，ROS的釋放在急性肺損傷病理發展過程中發揮重要作用[14-16]。在mIMCD3細胞中，高NaCl能引起ROS及羰基化蛋白(蛋白氧化性損傷的標志)[17-18]。ROS還可以引起氧化還原敏感性轉錄因子NF-κB、AP-1的增加，導致炎性細胞因子及趨化因子大量激活，進而引起炎癥反應[19]。

在病理情況下，內質網內未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白大量積聚可引起未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)，降低內質網負擔，起到保護細胞生存的功能。但是隨著外界刺激增大，內質網應激水平加劇，UPR活性受到抑制，引起蛋白質在內質網中加工及運輸障礙，引起細胞損傷[10, 20]。

ER的生理功能與細胞內氧化還原水平密切相關，既往研究表明，在急慢性肝損傷中ROS可能作為ERS的上游信號發揮作用[21-22]。正常狀態下，ER特異性蛋白GRP78(glucose-regulated protein 78)與內質網膜上三種感受蛋白ATF6、PERK、IRE1結合[10, 23]。而在細胞應激狀態下，ER內錯誤折疊蛋白及非折疊蛋白積聚，GRP78從感受蛋白上解離，轉而結合非折疊蛋白，感受蛋白激活，激發下游信號傳導通路，導致細胞損傷[24-26]。

本實驗發現，海水刺激人肺上皮細胞后，細胞增殖活性明顯受到抑制，且呈濃度依賴性。隨著海水刺激后恢復時間延長，細胞活性抑制程度呈現先降低后恢復的改變。有趣的是，我們發現海水刺激后細胞內ROS水平和ERS標志性蛋白GRP78表達也升高，并且趨勢與細胞增殖活性受抑制的趨勢一致。可以推論，細胞內ROS和ERS參與了海水刺激導致的細胞損傷病理過程。

綜上所述，本實驗通過用海水干預人肺泡上皮細胞建立海水淹溺性肺損傷模型，顯示海水刺激通過上調肺上皮細胞內ROS及ERS水平，引起肺泡上皮細胞損傷，導致急性肺損傷，本實驗的結果為闡明海水淹溺性肺損傷的病理過程提供了新思路，但其確切機制還需進一步實驗研究。

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(本文編輯：黃紅稷)

李鵬程，李聰聰，魯曦，等. 海水干預下人肺泡上皮細胞活性氧及內質網應激水平的變化[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 489-493.

JinFaguang,Email:jinfag@163.com

Objective To investigate the effect of seawater on the levels of reactive oxygen species (ROS) and endoplasmic reticulum stress (ER stress) in human alveolar epithelial cells. Methods The A549 cells were stimulated with cell culture medium containing different concentrations of seawater (20%, 40%, 60%, 80%) for 1 hour, then the culture medium was replaced for 3 hours, and then the CCK-8 method was used to detect the cytotoxicity of seawater; CCK-8 assay was used to detect the cytotoxicity of seawater on the cells at different time points (2 h, 4 h, 6 h, 8 h)after A549 cells were stimulated with 25% concentrations of seawater 1 hour. The expression of ER stress related protein (GRP78) was detected by Western blotting method. The level of intracellular ROS was detected by DCFH-DA probe. Results When the A549 cells were stimulated with different concentrations of seawater, the inhibition degree of the cell proliferation activity showed a concentration-dependent manner, compared with the control group, the difference was statistically significant (P<0.05); When the cells were recovered from the sea water stimulation, the cell activity was still significantly inhibited, the most significant inhibition in 4 h, followed by a gradual recovery , Compared with the 0 h group, the 2 h and 8 h group had no significant difference (P>0.05), and the difference of 4 h and 6 h group was statistically significant (P<0.05); At the same time, the content of ROS increased, and the expression of GRP78 increased, and all of them reached the peak value at 4 h. Conclusion Seawater intervention can inhibit the proliferation of human alveolar epithelial cells, and the ER stress and ROS are involved in the process of A549 cell damage induced by seawater.

Acute lung injury; Reactive oxygen species; Endoplasmic reticulum stress; Seawater

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.004

國家自然科學基金資助項目(81570067)

710038 西安，第四軍醫大學唐都醫院呼吸與危重癥醫學科1030001 太原，山西醫科大學基礎醫學院2710038 西安，第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科3

金發光，Email: jinfag@163.com

R563

A

2016-03-11)

吳秀琳，李明霞，蔡俊，等. 轉錄激活因子3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 484-488.

Changes of reactive oxygen species and endoplasmic reticulum stress level in human alveolar epithelial cells induced by seawaterLiPengcheng1,LiCongcong1,LuXi1,WangBorong1,LiYujuan2,HeMing3,JinFaguang1.1DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China;2CollegeofBasicMedicalSciences,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;3DepartmentofThoracicSurgery,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China