倍比稀釋法在醫(yī)學實驗室試劑篩選應用中的研究

王玉蘭，劉培海，王遠忠，閆榮軍，付汝坤

(1.日照出入境檢驗檢疫局，山東日照　276800；2.濟南出入境檢驗檢疫局　250000)

·論著·

倍比稀釋法在醫(yī)學實驗室試劑篩選應用中的研究

王玉蘭1，劉培海1，王遠忠2，閆榮軍2，付汝坤1

(1.日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276800；2.濟南出入境檢驗檢疫局250000)

摘要:目的探討倍比稀釋法在指導實驗室篩選質(zhì)量可靠檢測試劑中的應用價值。方法通過對丙型肝炎病毒陽性血清標本進行倍比稀釋，采用3種不同的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測結(jié)果比對，并結(jié)合聚合酶鏈反應(PCR)檢測結(jié)果實施驗證。結(jié)果A、B和C 3種ELISA試劑檢測結(jié)果陽性率之間差異有統(tǒng)計學意義；ELISA試劑檢測出現(xiàn)全部陽性結(jié)果到全部陰性結(jié)果的梯度間均存在1個梯度差，PCR試劑檢測全部陽性結(jié)果最大稀釋梯度與ELISA(C)試劑檢測結(jié)果具有較好的一致性。結(jié)論倍比稀釋法為實驗室篩查與選用質(zhì)量可靠的檢測試劑提供了良好的技術方法。

關鍵詞:倍比稀釋法；醫(yī)學實驗室；試劑篩選

倍比稀釋就是按照一定的比例對一定濃度的溶液進行稀釋，以得到濃度較低的溶液，本方法廣泛應用于血清免疫學、微生物學等臨床和科學研究領域[1-6]。為探索實驗室試劑篩查與選用的有效方法，本文以丙型肝炎病毒(HCV)陽性血清標本為試驗研究對象，采用倍比稀釋法對其進行稀釋后采用不同廠家的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測比對，同時結(jié)合聚合酶鏈反應(PCR)檢測結(jié)果實施驗證，論證倍比稀釋法在實驗室檢測試劑篩選中的應用價值，為指導實驗室篩查與選用質(zhì)量可靠的ELISA檢測試劑提供一種有效的方法。

1材料與方法

1.1標本來源選取健康人群傳染病監(jiān)測體檢過程中查出的HCV陽性患者的血清標本，樣品編號為1402170129。

1.2試劑來源HCV ELISA檢測試劑盒分別為A、B和C 3個廠家的檢測試劑，HCV RNA提取試劑盒和HCV RNA檢測試劑盒均為廣州維伯鑫廠家的檢測試劑，以上試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3儀器設備ELISA檢測采用1575型洗板機和680型酶標儀；PCR檢測采用Step one plus型熒光定量PCR儀。

1.4倍比稀釋將HCV陽性血清標本采用生理鹽水進行15個梯度的倍比稀釋，終濃度分別為1∶1原倍、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192和1∶16 384，樣品倍比稀釋后的每個稀釋梯度均作為1份獨立的樣品。采用3種HCV ELISA試劑和1種HCV熒光PCR試劑分別進行ELISA和PCR檢測，ELISA重復10次，PCR重復5次。操作方法均按照試劑盒說明書要求進行。

1.5統(tǒng)計學處理梯度統(tǒng)計至全部試劑出現(xiàn)全部陰性結(jié)果的梯度為止，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，計數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各種檢測試劑檢測結(jié)果比較見表1。由表1可見，A、B和C 3種ELISA試劑檢測的陽性率分別為69.17%、80.83%和87.50%，陽性率之間經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.53，P<0.05)，其中ELISA(A)與ELISA(B)試劑檢測陽性率之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.36，P<0.05)，ELISA(A)與ELISA(C)試劑檢測陽性率之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.88，P<0.05)，而ELISA(B)與ELISA(C)試劑檢測陽性率之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.00，P>0.05)。PCR檢測陽性率為83.33%，擁有理想的實時與線性擴增曲線圖，見圖1和圖2。PCR與ELISA試劑檢測陽性率比較結(jié)果顯示，PCR與ELISA(A)試劑檢測陽性率之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.16，P<0.05)，與ELISA(B)試劑檢測陽性率之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.17，P>0.05)，與ELISA(C)試劑檢測陽性率之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.58，P>0.05)。

2.2各試劑檢測結(jié)果梯度區(qū)間比較見表2。從梯度區(qū)間看，ELISA(A)、(B)和(C)3種試劑出現(xiàn)全部陽性結(jié)果的最高稀釋梯度分別為1∶128、1∶256和1∶512，出現(xiàn)全部陰性結(jié)果的最低稀釋梯度分別為1∶512、1∶1 024和1∶2 048。PCR試劑全部陽性結(jié)果的最高稀釋梯度和全部陰性結(jié)果的最低梯度分別為1∶512和1∶1 024。

表1　　HCV樣品倍比稀釋不同試劑檢測陽性結(jié)果比較[n(%)]

注：1∶1～1∶128稀釋梯度間陽性率均為100.00%，表中略去，合計欄含有關數(shù)據(jù)。

圖1　　HCV樣品倍比稀釋熒光PCR實時擴增曲線圖

圖2　　HCV樣品倍比稀釋熒光PCR線性擴增曲線圖

倍比稀釋梯度ELISA(A)ELISA(B)ELISA(C)PCR全部陽性結(jié)果最高稀釋梯度1∶1281∶2561∶5121∶512全部陰性結(jié)果最低稀釋梯度1∶5121∶10241∶20481∶1024

3討論

3.1不同ELISA試劑檢測結(jié)果比較結(jié)果顯示，ELISA(A)、(B)和(C)3種試劑檢測陽性率分別69.17%、80.83%和87.50%，陽性率之間差異有統(tǒng)計學意義，由此說明3種試劑對上述樣品檢出率是不同的。由于本次試驗是在同一檢測系統(tǒng)條件下進行的，除了使用的試劑不同外，檢測過程及條件是一致的。本文認為，這種檢測結(jié)果差異的產(chǎn)生，可能與試劑內(nèi)相應抗體包被的濃度有關。由于ELISA測試反映抗原與抗體的結(jié)合呈線性關系，隨著樣品中抗原濃度被梯度稀釋，其濃度呈比例下降，當樣品中抗原濃度低于試劑中抗體濃度時，抗原抗體復合物的形成也開始逐漸下降[7]。由此可見，3種試劑包被的抗體量(核心抗體與非核心抗體比例)可能存在差異，導致了不同試劑檢測陽性率不同。在3種試劑檢測結(jié)果中，出現(xiàn)全部陽性結(jié)果到全部陰性結(jié)果的梯度之間均存在1個梯度差的梯度區(qū)間，該梯度區(qū)間的產(chǎn)生可能是由于操作系統(tǒng)引起的，表明操作系統(tǒng)某環(huán)節(jié)存在操作誤差。這種誤差是否與加樣過程有關，有待于進一步探討。實驗室可以通過對該梯度區(qū)間分析，作為查找操作系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生檢測結(jié)果差異的有效方法和途徑。文獻[8-9]報道，ELISA檢測結(jié)果判斷有一個灰度區(qū)間。本文認為這個灰度區(qū)間也可能是對樣品倍比稀釋后檢測出現(xiàn)全陽性結(jié)果至全陰性結(jié)果產(chǎn)生梯度區(qū)間的重要原因。上述結(jié)果表明，在實驗室檢測系統(tǒng)一致的情況下，對相同樣品進行倍比稀釋后采用不同的ELISA試劑檢測結(jié)果進行比較分析，可較好地對市售ELISA檢測試劑進行有效篩查、選擇，保證實驗室檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

3.2熒光PCR與不同ELISA試劑檢測結(jié)果的比較分析文獻資料報道，熒光PCR可以較好地從分子生物學方面對細菌病毒核酸進行定性或定量檢測，可以從實時和線性擴增曲線中看出有或無擴增，準確性和靈敏性高，假陽性率低，可廣泛應用于臨床領域?qū)膊〉脑\斷和其他研究領域[10-16]。本次熒光PCR試劑檢測結(jié)果陽性率為83.33%，與ELISA(A)試劑檢測陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義，而與ELISA(B)和ELISA(C)試劑檢測陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義。熒光PCR試劑檢測未出現(xiàn)全部陽性結(jié)果至全部陰性結(jié)果的梯度區(qū)間，其檢測結(jié)果最高稀釋梯度(1∶512)在ELISA(B)與ELISA(C)梯度區(qū)間內(nèi)，由此表明這兩種ELISA試劑，特別是ELISA(C)試劑更接近于熒光PCR試劑的檢測結(jié)果，因此認為ELISA(C)試劑檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果具有較好的一致性。

3.3倍比稀釋法用于醫(yī)學實驗室篩選檢測試劑的有效性分析采購并使用質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑是保證實驗室檢測結(jié)果準確性和可靠性的重要保措施通常用于對試劑的質(zhì)量評價指標也較多，有的操作及使用復雜，有的需要多項指標綜合使用實施評價。本文使用陽性樣品，通過采用倍比稀釋法對實驗室ELISA檢測試劑的檢測結(jié)果進行比對，比較不同試劑的陽性率和梯度區(qū)間指標，并采用PCR進行驗證，比較不同試劑檢測效率，可以較好地確定實驗室需要采購的ELSIA試劑的產(chǎn)品及其質(zhì)量。將過去或陰或陽的靜態(tài)樣品用于檢測試劑的驗證、室間比對、能力驗證等活動，通過該方法對陽性樣品進行倍比稀釋后，將樣品靶物進行動態(tài)化，形成梯度變化，達到對試劑檢測效能進行檢驗的目的。

本研究表明，倍比稀釋法可為實驗室篩查與選用質(zhì)量可靠的檢測試劑提供良好的技術方法，該方法同樣也可以用于室間比對、能力驗證等質(zhì)量監(jiān)控活動中，具有較高的實用性。

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Application research for doubling dilution method in screening of medical laboratory reagents

WANGYulan1,LIUPeihai1,WANGYuanzhong2,YANRongjun2,FURukun1

(1.RizhaoEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Rizhao,Shandong276800,China;2.JinanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Jinan250000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore application value of doubling dilution method in screening of medical laboratory reagents.MethodsBy the method of doubling dilution,positive serum samples of the hepatitis C virus (HCV) were diluted.Three different enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (A,B and C) were used to detect the samples.PCR testing were used to verify the results.ResultsThe differences of positive rate between three ELISA reagents had statistic significance (P<0.05).There was a gradient interval for gradients from all positive results to all negative results for three ELISA reagents.The maximum dilution of positive results of PCR were commendably consist with the results of ELISA reagent C.ConclusionDoubling dilution method can be regarded as a kind of good technical approach for guiding medical laboratory on screening of reliable reagents.

Key words:doubling dilution method;medical laboratory;reagents screening

作者簡介：王玉蘭，女，主管檢驗師，主要從事衛(wèi)生檢疫實驗室管理方面的研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.024

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1510-03

(收稿日期：2016-01-11修回日期：2016-03-19)