姜黃素對HIV-1 gp120多肽誘導的大鼠神經元HSP70 mRNA表達的影響*

巫金娜黃莉文

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姜黃素對HIV-1 gp120多肽誘導的大鼠神經元HSP70 mRNA表達的影響*

巫金娜①黃莉文①

【摘要】目的：初步闡明姜黃素對HIV-1 gp120多肽誘導的大鼠神經元HSP70 mRNA表達的影響。方法：采用流式細胞術檢測HIV-1 gp120多肽誘導大鼠神經元凋亡情況；采用實時定量PCR（Realtime PCR）檢測熱休克蛋白70（HSP70）的表達情況，分析姜黃素對大鼠神經元HSP70 mRNA的影響。結果：HIV-1 gp120多肽可誘導大鼠神經元凋亡。姜黃素可緩解HIV-1 gp120 V3區多肽誘導神經元凋亡。HIV-1 gp120多肽可降低大鼠大腦皮質神經元HSP70 mRNA的表達。姜黃素能提高大鼠皮質神經元HSP70 mRNA表達，減輕HIV-1 gp120多肽誘導的神經元凋亡。結論：姜黃素可調節HSP70 mRNA表達，減輕HIV-1 gp120多肽誘導神經元凋亡。

【關鍵詞】姜黃素； 人類免疫缺陷病毒1型； 糖蛋白120； 熱休克蛋白70； 細胞凋亡

①廣州醫科大學附屬口腔醫院 廣東 廣州 510140

20世紀80年代，首例獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）病例被報道。AIDS由人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）所致，病毒可通過其包膜糖蛋白gp120，引發中樞神經系統細胞功能障礙［1-2］，進而導致神經退行性病變或神經認知障礙。但HIV-1導致中樞神經系統損傷的具體機制仍不清楚。雖然高效抗逆轉錄病毒療法（HAART）有效地降低了艾滋病患者的死亡率和全身性機會性感染的發生率，但由于血腦屏障的存在，抗病毒藥物很難進入中樞神經系統。因此迫切需要開發新的抗HIV-1腦病的藥物。熱休克蛋白70（HSP70）是一個分子量為70kDa的熱休克蛋白應激誘導分子，研究發現，HSP70對神經變性疾病具有神經保護功能［4］。姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取的疏水多酚，能改善HIV-1 gp120引起的記憶障礙［5］。在本研究中，我們旨在闡明姜黃素對HIV-1 gp120多肽誘導的大鼠神經元HSP70 mRNA表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠30只用于取大鼠大腦皮質神經元［License No.SCXK（yue）（2006-0015）］購自廣東省醫學實驗動物中心。其中正常組5只、對照組5只、模型組5只、0.5 μg/mL多肽組5只、1 μg/mL多肽組5只、0.5 μg/mL姜黃素處理組5只、1 μg/mL姜黃素處理組5只，所有動物實驗進行協議均通過本院倫理委員會批準。

1.2細胞培養方法 原代大鼠皮質神經元均參照早前的報道研究［6］，并做了輕微的調整。具體為：處死大鼠，將新鮮皮質組織分為約1 mm的切片，放置在15 mL離心管（D-Hanks 溶液與0.25%胰蛋白酶體積比為2∶1）中，37 ℃消化10 min，離心5 min，懸浮沉淀，過篩，將神經元接種在6孔培養板（含聚-L-賴氨酸）上，37 ℃，5% CO2培養4 h，更換含2% B27的neurobasal培養基（Life Technologies-Gibco，Grand Island，NY，USA）培養，以確保神經元構成大于95%。

1.3多肽序列及合成 多肽序列：Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly（分子式：C114H199N41O31；分子量：2，640.06），由上海生工合成。

1.4細胞凋亡分析 采用FITC標記的膜聯蛋白V 和PI法分析細胞凋亡情況。HIV-1 gp120 V3區多肽成功誘導大鼠大腦皮質神經元凋亡后，將大鼠大腦皮質神經元與終濃度為0.5 μg/mL及1 μg/mL的姜黃素分別共同孵育。首先將大鼠皮質神經元接種在6孔板，5 d后加入HIV-1 gp120多肽（0.5μg/mL、1μg/mL）處理48 h，用預冷PBS洗滌細胞，用1X結合緩沖液懸浮細胞。將懸浮液轉移到含有FITC膜聯蛋白V和PI的培養管中，輕輕渦旋并孵育15 min；加入1X結合緩沖液。利用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。隨后，分別沉默及過表達大鼠大腦皮質神經元HSP70基因，觀察姜黃素對HIV-1 gp120多肽所致大鼠大腦皮質神經元凋亡率的影響。

1.5構建腺病毒載體 按照以往方法進行［7］。利用Adeasy系統，將HSP70連接到pShuttle載體上，用T4連接酶連接；感受態細胞轉化，涂平板（卡拉霉素），37 ℃過夜。挑取30個克隆，提取DNA并用PacI篩選，瓊脂糖電泳（0.8%），并測序鑒定。

1.6實時定量PCR 提取細胞RNA，并逆轉錄至cDNA。所有試劑均自ABI（Applied Biosystems）。所得產物保存于4 ℃。利用使用說明書優化Realtime PCR反應條件。采用ABI 7500 Real-time PCR儀進行反應。數值由2Ct（calibrator）-Ct （test）計算得出。利用Real-time PCR檢測gp120多肽處理的大鼠皮層神經元中HSP70 mRNA的表達情況，分析姜黃素對大鼠皮層神經元HSP70的影響。

1.7統計學處理 采用PEMS 3.1統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，計數資料以百分比表示，比較采用 X2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1HIV-1 gp120多肽對大鼠皮層神經元的作用 采用流式細胞術檢測HIV-1 gp120多肽所致的神經元凋亡率可發現，經（0.5 μg/mL及1 μg/mL）多肽處理后，神經元凋亡比例為17.4%（圖1），HIV-1 gp120多肽可誘導大鼠皮層神經元凋亡。

圖1　HIV-1 gp120多肽誘導大鼠皮層神經元凋亡

2.2HIV-1 gp120多肽對大鼠大腦皮質神經元HSP70 mRNA表達的影響 采用Real-time PCR檢測HIV-1 gp120多肽處理的大鼠皮層神經元中HSP70 mRNA的表達情況發現，與對照組相比，0.5 μg/mL多肽組的HSP70 mRNA表達水平為（0.56±0.06），而1 μg/mL多肽組HSP70 mRNA表達水平為（0.38±0.03），多肽處理可下調大鼠大腦皮質神經元HSP70 mRNA表達。

2.3姜黃素對大鼠皮質神經元HSP70 mRNA表達的影響 采用Real-time PCR分析姜黃素對大鼠皮層神經元HSP70 mRNA的影響發現，與對照組相比，大鼠皮質神經元經不同濃度的姜黃素（0.5 μg/mL及1 μg/mL）處理后，HSP70 mRNA表達顯著提高，分別為（1.59±0.16）、（2.38±0.23），姜黃素可以增加HSP70 mRNA表達。

2.4姜黃素對HIV-1 gp120多肽誘導的大鼠皮層神經元的影響 與模型組相比，0.5 μg/mL姜黃素處理組HSP70 mRNA的表達為（1.18±0.13），1 μg/mL 姜黃素處理組HSP70 mRNA的表達為（1.22±0.15）；姜黃素可以增加大鼠大腦皮質神經元中HSP70 mRNA的表達。與HIV-1 gp120多肽處理組對比，沉默HSP70基因后，0.5 μg/mL姜黃素處理組cleaved caspase-3 mRNA表達為（1.16±0.15），1 μg/mL姜黃素處理組表達為（1.23±0.13）；姜黃素處理組中凋亡特異性蛋白cleaved caspase-3 mRNA表達更高。

3　討論

研究表明，HIV-1可致神經系統功能障礙，其重要特征是神經元凋亡［8］。HIV-1包膜糖蛋白HIV-1 gp120能夠在小鼠體內誘導出類似HIV-1相關性癡呆患者的神經病理變化［9］。此外，HIV-1 gp120可通過caspase-3途徑，產生神經毒性［10］。HSP70是分子量為70kDa的具有較高的神經保護能力熱休克蛋白［11］。研究結果表明，在神經退行性疾病帕金森綜合癥中，HSP70可作為分子伴侶產生神經保護作用［12］。并且，HSP70能調節Apaf-1和AIF信號通路，減輕并抑制原代皮質神經元和SH-SY5Y細胞凋亡［13］。姜黃素是從姜科、天南星科的植物根莖中提取的一種能夠穿過血腦屏障化學物質［14］。以往的研究發現，姜黃素與HIV-1核苷酸序列的長末端重復序列（LTR）結合，抑制后者活性。姜黃素還可抑制HIV-1復制所需的蛋白酶、整合酶以及與HAD相關的一些細胞因子（TNF-α，IL-1β等）以及一氧化氮、自由基等［15］。

本研究表明，HIV-1 gp120多肽可降低HSP70 mRNA表達。姜黃素可調節HSP70 mRNA表達，降低HIV-1 gp120多肽所致的大鼠大腦皮質神經元凋亡。這些結果表明，姜黃素可通過調節HSP70 mRNA表達情況，降低大腦皮質神經元凋亡率。這使姜黃素有望開發成為新的治療HIV相關性癡呆的藥物。但由于HIV-1相關性腦病的復雜性，姜黃素對HIV-1相關性腦病的干預作用仍需進行大規模的實驗來證實。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.008

*基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金項目（A2015335）

通信作者：巫金娜

收稿日期：（2015-12-08） （本文編輯：蔡元元）