miR-21在川崎病急性期患者血清中的表達及其臨床意義

賈連紅，潘璐璐，盧家程，耿志敏，吳蓉洲，褚茂平

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院　兒童中心，浙江　溫州　325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院　兒童心臟中心，溫州醫科大學心臟發育與轉化醫學研究所，浙江　溫州　325027）

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miR-21在川崎病急性期患者血清中的表達及其臨床意義

賈連紅1，潘璐璐2，盧家程1，耿志敏1，吳蓉洲2，褚茂平2

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院兒童中心，浙江溫州325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院兒童心臟中心，溫州醫科大學心臟發育與轉化醫學研究所，浙江溫州325027）

［摘 要］目的：探討micrRNA-21（miR-21）在川崎病（KD）患者血清中的表達及其臨床意義。方法：收集溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院2014年1月-2015年6月收治的33例KD患者以及15例健康體檢者的血清標本，以 cel-miR-39為外參基因，通過實時定量PCR（RT-qPCR）檢測血清miR-21的表達，并通過受試者工作特征（ROC）曲線評估其作為KD疾病標記物的診斷價值。結果：miR-21在KD急性期患兒血清中表達水平明顯高于健康兒童血清（P＜0.05），恢復期則降低至正常水平。ROC曲線顯示，以miR-21診斷KD的曲線下面積（AUC）為0.736（95%CI：0.531～0.941），當臨界值（診斷閾值）取1.09時，其診斷靈敏度和特異度分別為0.846和0.714。血清miR-21表達與KD臨床特征相關分析顯示，高血小板水平血清中miR-21表達更高。結論：KD患者血清miR-21水平顯著升高，可能是KD診斷的潛在血清標志物之一。

［關鍵詞］川崎病；microRNA-21；疾病診斷

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種主要發生在5歲以下嬰幼兒的急性發熱出疹性疾病，其主要病理改變為全身非特異性血管炎，其中冠狀動脈損害（coronary artery lesion，CAL）是KD嚴重并發癥，已取代風濕熱成為兒童后天性心臟病的主要病因［1-2］。由于KD的病因未明、發病機制不清，因此早期診斷并規范治療對降低KD冠狀動脈并發癥極為重要。然而，目前臨床上對KD的診斷主要依靠臨床表現［3-4］，缺乏特異性的檢驗指標。研究發現，血清中游離存在的miRNA是多種疾病新的生物標志。為此本研究選擇與多種心血管疾病的發生及發展密切相關的microRNA-21（miR-21），測定其在KD急性期血清中的表達水平，探討miR-21在KD診斷中的臨床價值。

1　資料和方法

1.1一般資料 選擇溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院2014年1月-2015年6月確診并收治的KD患兒33例，診斷依據美國兒童心臟協會制定的標準［5］，其中男25例，女8例，年齡均為5歲以下，平均（25.6±18.6）月，經超聲心動圖檢測，存在冠狀動脈擴張或動脈瘤病變，即CAL（+）13例，無冠狀動脈病變，即CAL（-）20例；KD恢復期組兒童均為急性期治療后兒童，共15例，其中男11例，女4例，平均年齡（21.8±18.7）月。選擇同期門診體檢健康兒童15例，其中男11例，女4例，年齡均為5歲以下，平均（20.4±9.9）月，排除肺、肝、腎、腦等重大疾病。各組研究對象的年齡、性別構成差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。臨床資料見表1。

表1　3組研究對象臨床資料（±s）

表1　3組研究對象臨床資料（±s）

D-二聚體（μg/mL）男女性別（n/%）組別　例數　年齡（月）　白細胞（×109/L）血小板（×109/L）谷丙轉氨酶（U/L）谷草轉氨酶（U/L）健康兒童　15　11/73.3　4/26.7　20.4± 9.9　8.17±2.59　341.5± 71.52　20.58±　9.81　37.35±　6.32　0.39±0.19 KD恢復期　15　11/73.3　4/26.7　21.8±18.7　8.27±2.63　582.31±126.09 60.73± 61.88　63.54± 31.40　0.84±0.66 KD急性期CAL（+）13　10/76.9　3/23.1　26.4±18.1　18.98±9.30 421.50±117.36 70.71± 58.96　50.21± 49.90　1.27±0.97 CAL（-）　20　15/75.0　5/25.0　24.6±19.2　14.86±5.39 395.40±121.40 75.27±115.32 58.47±129.28　1.48±1.16

1.2主要試劑與儀器 Tri-reagent-BD購自美國Sigma公司；miScript II RT Kit、miScript Primer Assay、miScript SYBRGreen PCR Kit購自QIAGEN公司；外參cel-miR-39由上海吉瑪公司合成。定量PCR儀器為Bio-Rad的C1000 Touch Thermal Cycler。

1.3RNA提取和miR-21表達檢測 所有兒童抽取空腹靜脈血2 mL，經3 000 r/min離心10 min分離血清，經12 000 r/min高速離心15 min去除細胞碎片，取上層血清200 μL，加入750 μL Trizol劇烈震蕩后加入等量外參，冰上放置15 min后加入200 μL氯仿劇烈震蕩30 s，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min后，取上清350 μL于新去RNase的EP管內，加入等量異丙醇-20 ℃過夜后，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，棄上清后加入1 mL 80%乙醇洗滌，離心后加入15 μL DEPC水溶解RNA，利用miScript II RT Kit將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模版，在C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀上，利用實時定量PCR（RT-qPCR）對miR-21進行定量檢測。按照試劑盒說明書，反應條件為預變性95 ℃ 15 min，95 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，擴增40個循環。所有樣品均做3個平行孔，循環數取其均數。以cel-miR-39為外參，miR-21的相對表達量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct外參基因。

1.4統計學處理方法 應用SPSS16.0統計學軟件。采用獨立樣本t檢驗比較KD患兒與健康兒童血清miR-21表達的差異，采用配對t檢驗比較KD患兒急性期與恢復期血清miR-21表達的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。利用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析和曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）評估血清miRNA作為疾病診斷標記物的價值。

2　結果

2.1miR-21在KD患者血清中表達分析 由于KD血清miRNA定量檢測目前尚無適宜的內參基因，為此本研究選用與人無同源性的線蟲cel-miR-39作為外參照。結果顯示，KD急性期、健康兒童及KD恢復期血清miR-21表達水平分別為3.04±1.76、1.13± 0.89及1.75±1.14，KD急性期患兒血清miR-21表達水平明顯高于健康對照兒童（P＜0.05），而疾病恢復期即下降至接近健康兒童水平。

2.2血清miR-21作為KD疾病診斷的評價 利用R軟件制作ROC曲線，評價miR-21在KD中的診斷價值。如圖1所示，血清miR-21診斷KD的ROC曲線的AUC為0.736（95%CI：0.531～0.941），當臨界值（診斷閾值）取1.09時，其靈敏度為0.846，特異度為0.714，具有較好的診斷價值。

2.3血清miR-21表達水平與KD臨床特征關系 進一步分析血清miR-21相對表達量與KD患兒臨床特征的關系，結果如表2所示，miR-21在血小板計數高于300×109/L的兒童血清中的表達明顯高于血小板計數正常兒童的血清（P＜0.05），而在其他實驗室指標上差異無統計學意義（P＞0.05）。將33例KD患兒按照有無CAL進行分類，分析發現miR-21表達在有無CAL中差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1　血清miR-21對KD急性期診斷作用的ROC曲線

表2　miR-21與KD臨床特征相關性分析（n=33，±s）

表2　miR-21與KD臨床特征相關性分析（n=33，±s）

臨床特征　miR-21　P白細胞（×109/L）5～12　3.90±2.65　0.297 ＞12　2.26±2.18血小板（×109/L）100～300　0.91±1.21　0.041 ＞300　3.47±2.22谷丙轉氨酶（U/L）7～40　2.63±2.11　0.988 ＞40　2.65±2.60谷草轉氨酶（U/L）13～35　2.46±1.98　0.776 ＞35　2.84±2.79 D-二聚體（μg/mL）0～0.5　1.02±0.98　0.297 ＞0.5　2.93±2.36 CAL （-）　2.93±7.05　0.839 （+）　2.50±3.44

3　討論

KD，又稱為黏膜皮膚淋巴結綜合征，由日本的川崎富首次報道，是一種以全身中小血管炎為主要病變的急性全身出疹性免疫性疾病，主要累及中小動脈，尤其是冠狀動脈，雖然醫學診療技術不斷發展，以丙種球蛋白為主的綜合治療方案取得了一定的效果，但仍有部分KD患者診斷不及時，導致并發嚴重冠狀動脈病變。因此及時診斷KD，是預防冠狀動脈并發癥的最佳手段。

miRNA在心血管中的研究屢見不鮮。Fish等［6］發現，miR-126在血管發育過程中，尤其是在保持血管的完整性和血管生成中發揮調節作用。Mitchell等［7］證實血清中存在豐富而且穩定的miRNA，這些miRNA不易被血清中的RNase降解，而血清標本易于取得，且對患兒的損傷小，其作為生物標記物具有明顯優勢。血清中miR-29a和miR-92a的表達情況對結直腸癌的早期診斷具有一定價值［8］。而miRNA在KD中的研究報道較少，2013年，Shimizu等［9］首次報道差異表達的miR-145可能通過TGF-β通路參與KD的發生。Yun等［10］通過芯片發現，與健康兒童比較，KD患兒血清中存在特異相關的miRNAs，如miRNA-200c和miRNA-371-5p。Rowley等［11］認為miRNA可能成為KD的潛在生物學標志物。Ni等［12］研究發現，miR-155、miR-21和miR-31能夠調控Treg細胞基因的表達從而參與KD的發生。

miR-21在心血管病中的作用備受關注。Zhou等［13］發現，miR-21參與了血管炎癥反應的發生。Li等［14］發現，miR-21能夠通過靶向AP-1調控血管平滑肌細胞的增殖和遷移，進而參與血管疾病的發生。另外，miR-21在動脈粥樣硬化循環內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）中呈高表達，能夠通過TGF-β通路影響EPCs的增殖［15］，動脈粥樣硬化斑塊中miR-21亦呈高表達狀態［16］。有學者發現，miR-21可以通過對肌球蛋白的作用而影響平滑肌的功能［17］，肺動脈平滑肌細胞經過低氧處理后miR-21表達升高［18］。Ji等［19］證實，在損傷的血管中miR-21表達增高，而抑制miR-21表達后，血管損傷程度有所減輕。剪切力是引起血管損傷的常見因素，當剪切力作用于血管內皮細胞后，內皮細胞內miR-21表達量升高［20-21］。由此可見，miR-21在多種心血管疾病中發揮一定作用，有望成為心血管疾病治療新的靶點。

本課題組前期研究發現，miR-23a在KD急性期血清中表達上調，并且對臍靜脈內皮細胞生長及遷移有一定影響［22］，提示miR-23a的異常可能參與KD內皮細胞的損傷過程。本課題組還發現，與健康兒童比較，KD外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的miR-130a和miR-125b存在差異表達，證實miR-130a和miR-125b可能參與了KD的發生與發展，可以作為KD診斷及預后評估的一項新的生物標志物［23］。本研究通過RT-qPCR檢測發現，miR-21在KD患者血清中的表達明顯升高，將血清miR-21作為KD診斷指標，其靈敏度和特異度均大于70%。但本研究所納入樣本量有限，仍存在偶然誤差的可能，其靈敏度和特異度以及臨界值的選擇還需在大樣本量的人群中進一步驗證。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Expression of miR-21 in patients with the acute phase of Kawasaki disease and its clinical signifi cance

JIA Lianhong1， PAN Lulu2， LU Jiacheng1， GENG Zhimin1， WU Rongzhou2， CHU Maoping2. 1.Department of Children’s Center， the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 2.Children’s Heart Center， the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital， Institute of Cardiovascular Development & Translational Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Abstract：Objective： To study the expression of miR-21 in the serum of patients with Kawasaki disease and its clinical signifi cance. Methods： Thirty-three cases of Kawasaki disease and 15 healthy control were collected from the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University in 2014 and 2015. With cel-miR-39 as the external reference gene， the expression of miR-21 was detected with realtime quantitative PCR， and its signifi cance as a marker in diagnosis was evaluated by ROC curve. Results： The expression of miR-21 in serum of KD patients was signifi cantly higher than that in the healthy control group （P＜0.05）， and return to normal level after treatment. ROC curve indicated miR-21 had a sensitivity of 84.6% and a specifi city of 71.4% for distinguishing KD patients from healthy children with an area under the curve （AUC）were 0.736 （95%CI︰ 0.531～0.941）. Further analysis of the clinical pathological features indicated that the level of serum miR-21was associated with PLT. Conclusion： Serum miR-21 level is signifi cantly elevated in KD patients， it may be used as a potential biomarker in diagnosis of KD.

Key words：Kawasaki disease； microRNA-21； disease diagnosis

［中圖分類號］R725.4

［文獻標志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.005

收稿日期：2016-01-22

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（LY12H02003）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2012ZDA035）；浙江省科技廳科研基金資助項目（2015C33163）。

作者簡介：賈連紅（1988-），女，河北三河人，碩士生。

通信作者：褚茂平，主任醫師，Email：chmping@hotmail.com。