生長抑制因子4在人胃癌中的表達及其意義

程海燕，沈哲，陳衛昌，嚴蘇

（1.紹興第二醫院　消化內科，浙江　紹興　312000；2.蘇州大學附屬第一人民醫院　消化內科，江蘇蘇州　215006）

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生長抑制因子4在人胃癌中的表達及其意義

程海燕1，沈哲1，陳衛昌2，嚴蘇2

（1.紹興第二醫院消化內科，浙江紹興312000；2.蘇州大學附屬第一人民醫院消化內科，江蘇蘇州215006）

［摘 要］目的：探討多種人胃癌細胞株中及胃癌組織中生長抑制因子4（ING4）的表達及其意義。方法：體外培養3種分化不同的胃癌細胞MKN-1（高分化）、SGC-7901（中分化）、BGC-823（低分化）以及人胃黏膜細胞GES-1，收集紹興第二醫院病理科40例原發胃癌患者的石蠟標本。以RT-PCR、Western Blot法分別檢測4種細胞株ING4 mRNA及其蛋白表達水平。免疫組織化學法檢測胃癌組織及癌旁組織中ING4蛋白表達情況。結果：SGC-7901、BGC-823組中ING4 mRNA及其蛋白表達水平較MKN-1、GES-1組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），BGC-823組中ING4 mRNA及其蛋白表達水平較SGC-7901組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），MKN-1組與GES-1組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。胃癌組織中ING4表達陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：ING4作為抑癌基因參與了胃癌的發生，且與胃癌分化程度有關。

［關鍵詞］生長抑制因子4；胃癌細胞系；反轉錄PCR；蛋白質印跡法；免疫組織化學法

生長抑制因子4（inhibitor of growth family member4，ING4）是由Shiseki等人發現的生長抑制因子家族的新成員，它是一種重要的抑癌因子。目前研究認為，ING4屬胞內蛋白，在人類正常組織中均有表達，而在多數腫瘤中出現轉錄水平下降［1-2］。本實驗主要檢測ING4 mRNA及其蛋白在不同分化的胃癌細胞及胃癌組織中的表達水平，探討其可能的表達機制及臨床意義。

1　材料和方法

1.1材料 胃癌細胞MKN-1（高分化）、SGC-7901（中分化）、BGC-823（低分化）以及人胃黏膜細胞GES-1均為蘇州大學細胞與分子生物學教研室惠贈。收集紹興第二醫院病理科40例原發胃癌患者的石蠟標本，依照病理科提供的資料進行癌組織及癌旁組織分類，患者年齡40～84歲。RPMI1640培養基購自GIBCO公司，ING4、β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，ING4一抗購自北京華夏遠洋科技有限公司，二抗購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組織化學染色試劑盒購自邁新生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養：不同細胞分別培養于含10%小牛血清的RPM1640培養液，培養條件為5% CO2，37 ℃，細胞接種在培養瓶后，分別收集處于對數生長期的細胞4×106個，將實驗分為GES-1、MKN-1、SGC-7901、BGC-823組。

1.2.2RT-PCR檢測ING4 mRNA表達：用Trizol一步法提取各組細胞總RNA。4 μg無DNA的總RNA反轉錄（mRNA至cDNA），PCR反應在25 μL反應體系中進行。該體系含有cDNA 2.0 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，ING4及β-action的上、下游引物（由primer 5軟件設計，南京金斯瑞生物科技公司合成）各0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0．2 μL。擴增基因的引物序列：ING4上游引物序列5’-GCGTCG ACATGGATGATGGGATGTATTTGGAAC-3’，下游引物序列為5’-GCAAGCTTCTATTTCTTCCGTTCTTGGGAG-3’，擴增片段248 bp。用β-actin作為內參照，上游引物為5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3’，下游引物序列為5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，其預測的產物長度為183 bp。PCR擴增的條件均為94 ℃預變性5 min，繼而95 ℃ 20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環，72 ℃延伸7 min。PCR產物在含10 mg/mL 2.5 μL溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，然后用凝膠成像分析儀開始攝像分析。最后用UVISOFT軟件處理數據，將目的條帶與內參條帶的平均灰度之比作為目的基因表達的相對含量。

1.2.3Western Blot檢測ING4蛋白表達：4組各取5×105個細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，取40 μg總蛋白制樣，經SDS/PAGE凝膠電泳，然后轉膜，用TBST配制的5%脫脂奶粉進行封閉，再用l︰1 000稀釋的一抗37 ℃搖床孵育1 h以上，l︰10 000稀釋的二抗室溫孵育3 h，將膜放入盛有TBST的平皿中進行洗膜，化學發光試劑溫浴20 min后曝光、顯影和定影，對結果進行吸光度掃描分析（明基5000掃描儀），與對照組結果進行對比。

1.2.4免疫組織化學染色檢測胃癌組織中ING4蛋白的表達：將40例胃癌組織及癌旁組織的蠟塊，進行ING4抗體的免疫組織化學檢測。具體步驟參照酶底物顯色劑（AEC-0037）說明書進行。在×40視野下觀察標本。ING4蛋白陽性表達為細胞核呈棕褐色或深棕色顆粒。

1.3統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析。數據以±s或百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1RT-PCR檢測各組細胞ING4 mRNA的表達 GES-1組、MKN-1組、SGC-7901組、BGC-823組細胞ING4 mRNA平均表達強度分別為：0.46±0.15、0.44± 0.11、0.32±0.08、0.23±0.04，隨著胃癌細胞的分化程度降低、惡性程度升高，ING4 mRNA表達逐漸下降，其中BGC-823組、SGC-7901組分別與GES-1細胞組比較ING4 mRNA表達強度明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），MKN-1細胞組與GES-1細胞組比較ING4 mRNA表達強度無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖1）。

圖1　4種細胞ING4 mRNA表達情況

2.2Western Blot檢測各組細胞ING4蛋白的表達 GES-1組、MKN-1組、SGC-7901組、BGC-823組相對灰度比分別為0.56±0.06、0.54±0.05、0.39± 0.03、0.25±0.01，隨著胃癌細胞的分化程度降低、惡性程度升高，ING4蛋白表達逐漸下降，其中BGC-823組、SGC-7901組分別與GES-1組比較，ING4蛋白表達強度明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），MKN-1組與GES-1組比較，ING4的蛋白表達強度無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖2）。

圖2　4種細胞ING4蛋白表達情況

2.3免疫組織化學檢測胃癌組織中ING4蛋白的表達 胃癌組織及癌旁組織中ING4蛋白表達情況見表1。具體評判標準為細胞中充滿了棕色顆粒的為陽性結果，其中，棕黃色為+，棕色為++，深棕色為+++，沒有棕色顆粒的為陰性結果。結果發現胃癌組織陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1　免疫組織化學檢測ING4蛋白在胃癌組織中的表達（n=40）

3　討論

胃癌是一種高發生率的惡性腫瘤，發生率居消化道腫瘤的首位。目前國內早癌的發現率仍低下，絕大部分發現時已屬中晚期，且手術根治率低，術后5年生存率一直維持在30%左右。因此，探索能夠預測胃癌及診斷的敏感指標，是眾多學者研究的焦點，其中關于生長抑制因子家族新成員ING4的研究更為熱門。

ING4是一種新發現的抑癌基因，它位于染色體12p13.31，包含了8個外顯子和7個內含子，有13 000個堿基對，編碼248個氨基酸。ING4基因突變或缺失導致腫瘤發生、發展的機制，可能與腫瘤細胞異常增殖、阻滯腫瘤細胞凋亡及促進腫瘤的侵襲、轉移等有關［3］。研究發現，ING4在頭頸部鱗狀細胞癌［4］、非小細胞肺癌細胞株［5］、結腸癌細胞株RKO［6］等多種惡性腫瘤細胞中出現表達明顯下降。2013年Zeng等［7］研究發現ING4表達水平的高低與肝癌的惡性程度有關。本研究發現，胃癌中、低分化細胞株中ING4 mRNA及其蛋白表達水平較胃癌高分化細胞株及正常胃黏膜細胞株明顯降低；低分化細胞株中ING4表達水平較中分化細胞株又明顯降低；而高分化細胞株ING4表達水平與胃正常黏膜細胞株之間無明顯差異。這與Shi等［8］研究發現ING4在胃腺癌細胞系表達下降一致，其機制可能是胃癌細胞中ING4下調導致NF-κB激活，有利于胃癌的發生、發展。本研究還發現，胃癌組織中ING4蛋白表達陽性率明顯低于癌旁組織。這與錢莉等［9］研究發現ING4蛋白在胃腺癌組織中明顯減少的結果相似。

綜上所述，ING4在胃癌細胞中低表達，且隨著胃癌細胞的惡性程度增高，表達逐漸降低，胃癌組織中ING4蛋白陽性率亦明顯低于癌旁組織，證實ING4表達降低與胃癌的發生、發展密切相關。

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（本文編輯：丁敏嬌）

?臨 床 經 驗?

Expression and significance of ING4 in human gastric cancer

CHENG Haiyan1， SHEN Zhe1， CHEN Weichang2， YAN Su2. 1.Department of Digestion， Shaoxing Second Hospital， Shaoxing， 312000； 2.Department of Digestion， the First Affi liated Hospital of Soochow Medical University， Suzhou， 215006

Abstract：Objective： To study the expression and significance of inhibitor of growth family member 4 （ING4） in many kinds of human gastric cancer cells and gastic cancer tissue. Methods： In the experimental group， there were three different typs of gastric cancer cells， MKN-1 （high differentiation）， SGC-7901 （moderate differentiation）and BGC-823 （low differentiation）. In the control group， there was a normal gastric mucosal cells GES-1. All cell lines were cultured in vitro. The mRNA and protein expression of ING4 were analyzed by RT-PCR and Western blot. Whether there was ING4 protein expression in gastric cancer tissue and adjacent tissue by immunohistochemistry. Results： The mRNA and protein expression of ING4 in SGC-7901 and BGC-823 groups were signifi cantly lower than that in MKN-1 and GES-1 groups. The difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. The mRNA and protein expression of ING4 in BGC-823 group were signifi cantly lower than that in SGC-7901 group. The difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. But there was no signifi cant different between MKN-1 group and GES-1 group （P＞0.05）. The positive rates of expression of ING4 protein in gastric cancer tissue was signifi cantly lower than that in adjacent tissue， the difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. Conclusion： ING4 protein as a tumor suppressor is associated with the development and prognosis of the gastric cancer， which provide theoretical basis for clinical use ING4 gene targeted therapy for gastric cancer in the future.

Key words：ING4； gastric cancer cell line； RT-PCR； Western blot； imunocytochemistry

［中圖分類號］R735.2

［文獻標志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.011

收稿日期：2016-01-18

作者簡介：程海燕（1981-），女，江蘇鹽城人，主治醫師，碩士。