miR-187在肺癌組織中的表達及其效應

孫德彬，藍秀

（麗水市中心醫(yī)院　呼吸內科，浙江　麗水　323000）

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miR-187在肺癌組織中的表達及其效應

孫德彬，藍秀

（麗水市中心醫(yī)院呼吸內科，浙江麗水323000）

［摘 要］目的：探討微小RNA（microRNA，miR）-187在肺癌組織中的表達及其效應。方法：以U6為內參，采用莖環(huán)實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測32例肺癌及其癌旁正常組織標本miR-187的表達量，并分析其表達與肺癌臨床病理特征間的關系。采用miR-187模擬物（mimics）上調A549肺癌細胞內miR-187表達水平，通過噻唑藍（MTT）法檢測細胞活性，通過流式細胞術檢測細胞周期。結果：與癌旁正常組織比較，miR-187在肺癌組織中表達顯著下調（t=5.236，P＜0.001）。臨床病理特征相關性分析結果顯示，腫瘤組織miR-187的表達與肺癌病理分級及臨床分期相關（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙史、腫塊大小、病理類型及淋巴結轉移情況未見明顯相關性（P＞0.05）。采用miR-187 mimics上調A549肺癌細胞內miR-187表達后，細胞增殖明顯受到抑制，G0/G1期細胞比例增高，G2/M期細胞比例明顯降低。結論：miR-187在肺癌組織中的下調表達可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

［關鍵詞］微小RNA；miR-187；肺腫瘤

肺癌的發(fā)病率與病死率在全世界范圍內增速迅猛［1］，我國目前肺癌病死率為30.61/10萬人，較30年前增加了465%，位居各種惡性腫瘤之首［2］。在后基因組時代，RNA組學研究逐漸成為熱點：基因組超過98%的轉錄產物為不編碼蛋白的非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA），其中微小RNA（microRNA，miR）可通過與靶mRNA的3’-UTR互補配對，指導mRNA切割、降解；也可通過與靶mRNA的不完全配對，沉默其表達，從而參與調控細胞的分化、生長、增殖和凋亡等［3-6］。近年來少數(shù)的研究已經證實，miR-187異常表達與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等相關，但其與肺癌的相關性迄今尚鮮見報道。為此，本研究進一步通過莖環(huán)實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法對32例肺癌組織及相對應的正常組織進行表達水平檢測，旨在分析miR-187表達與肺癌臨床病理特征的關系，并通過細胞干預實驗驗證miR-187的效應。

1　材料和方法

1.1材料 Trizol試劑、胎牛血清、lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)液、0.05% Trypsin購自美國Invitrogen公司；F12K培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；DNase I、RNase-free試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；ReverTra Ace? qPCR RT Kit、SYBR? Green Realtime PCR Master Mix等購自日本Toyobo公司；miR-187模擬物（mimics）及無關序列對照購自上海吉瑪公司；A549人非小細胞肺癌細胞購自中科院上海科學研究所細胞庫；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1組織標本采集及處理：標本取自2008年6 月-2012年7月間在我院胸外科行手術治療的肺癌患者32例，術前均未行放、化療等治療，年齡32～78歲，平均（45.5±12.3）歲，組織病理類型的判斷標準參照WHO肺癌的病理學分類。每例標本留取腫瘤組織及對應的正常肺組織（腫瘤遠端5 cm處的肺組織，并經組織病理切片檢測證實），離體后10 min內置于液氮保存待做后續(xù)分析。

1.2.2小RNA抽提：取液氮保存的肺癌組織及癌旁正常組織標本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理水溶解。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNase I說明書步驟進一步純化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）檢測RNA溶液OD260/OD280吸光值，計算RNA濃度和純度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于檢測。1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.3miR-187表達檢測：以U6作為內參，分析肺癌組織miR-187表達，相關分析的引物序列見表1。0.5 μg總RNA分別以U6 RT引物和miR-187莖環(huán)RT引物進行反轉錄。反轉錄體系按照ReverTra Ace? qPCR RT Kit說明書進行，反應條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。以20 μL反應體系進行RT-qPCR。測反應體系包括：1 μL RT產物，1×SYBR Green I Master mix，10 μmol/L特異前向引物、10 μmol/L特異反向引物。RT-qPCR條件為：95 ℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃30 s，40個循環(huán)。所有樣品做3復孔。RT-qPCR使用ABI StepOne/StepOnePlus RT-qPCR儀器進行檢測。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6作為內參照，以2-ΔΔCt表示miR-187在肺癌組織相對于癌旁組織的表達。ΔCt為同一樣本目的基因與內參基因Ct值之差，即ΔCt=CtmiR-187-CtU6，△△Ct=（CtmiR-187-CtU6）腫瘤-（CtmiR-187-CtU6）正常。miR-187相對表達水平＜1，表示肺癌組織miR-187的表達水平低于配對癌旁組織miR-187的表達；miR-187相對表達水平＞1，表示肺癌組織miR-187的表達水平高于配對癌旁組織miR-187的表達。PCR產物經3.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1　定量PCR檢測相關引物序列

1.2.4細胞培養(yǎng)及miR-187轉染：A549人非小細胞肺癌細胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素的F12K培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，23 d傳代一次。設20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L 3個不同濃度的miR-187 mimics干預組、無關序列組（NC組）及未轉染組（Blank組）。轉染前將2×105個細胞分別接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁率大約為60%～70%，將培養(yǎng)基替換為無血清Opti-mem培養(yǎng)基，按li-pofetmaine2000說明書轉染細胞，轉染24 h、48 h及72 h后去培養(yǎng)基，Hanks洗滌3次，加Trizol試劑收集細胞RNA，于80℃冰箱保存。

1.2.5細胞增殖與活性檢測：本次實驗設A549細胞Blank組、NC組和miR-187 mimics組（miR-187 mimics轉染濃度分別為20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L）。另設背景組（未接種細胞，只加入培養(yǎng)基）作為調零孔。實驗共分6個組，每組3個復孔。參照CCK-8試劑盒說明書，分別檢測上述各組細胞增殖情況。用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值（OD）。并計算細胞活力=（實驗組-空白孔）A450/（對照組-空白孔）A450×100%。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞周期：以2×105個細胞接種于6孔板，每孔2 mL，轉染前用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h，使得細胞周期同步在G0/G1期。取miR-187 mimics干預組及無NC組轉染的細胞，0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)液吹打，800×g離心15 min去上清，PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹勻，用5 mL注射器將細胞吸起，打入5 mL 70%（預冷）乙醇中，4 ℃固定過夜，800×g離心15 min收集固定細胞，PBS 洗2次，用0.4 mL PBS重懸細胞并輕輕吹打，加適當濃度的RNase-A，37 ℃水浴消化30 min，加入適當濃度的PI，在冰浴中避光染色30 min，過濾，流式細胞儀（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）分析檢測，每個樣本取3個復孔，每個復孔檢測1次，獲得數(shù)據(jù)后進行結果分析。

1.3統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。miR-187表達數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，肺癌組織與其配對癌旁組織miR-187平均表達水平比較采用配對的非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗；肺癌組織miR-187相對表達水平與胃癌臨床病理指標之間的關系采Mann-Whitney u檢驗（2組）和Kruskal-Wallis H檢驗（多組）進行統(tǒng)計學處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1miR-187檢測特異性分析 qPCR擴增產物的熔解曲線（見圖1A）顯示為單峰，肺癌組織和癌旁正常組織總RNA經特異引物RT-qPCR擴增后， miR-187 及U6內參的PCR產物為單一條帶（見圖1B），說明建立的RT-qPCR方法能特異檢測相應的目的基因。

圖1　miR-187和內參U6 qPCR特異性分析

圖2　肺癌組織及其配對癌旁正常肺組織miR-187平均表達水平

2.2肺癌組織miR-187表達水平 31例肺癌組織及其配對癌旁正常肺組織miR-187表達水平的RT-qPCR檢測結果（見圖2）表明，肺癌組織miR-187表達水平明顯低于配對癌旁正常肺組織（t=5.236，P＜0.001），肺癌組織miR-187相對表達水平為0.626 （0.283，0.827）。

2.3miR-187表達水平與肺癌臨床病理特征的關系 miR-187的表達在不同病理分級及臨床分期存在顯著差異（見表2）。不同病理分級的肺癌標本中，分化程度越低的肺癌組織miR-187表達水平越低（P=0.017），miR-187表達水平在III/IV期臨床分期的肺癌組織標本明顯低于I/II期的組織標本（P= 0.026）。miR-187表達水平和年齡、性別、吸煙史、腫塊大小、病理類型及淋巴結轉移情況未見明顯相關性（P＞0.05）。見表2。

表2　miR-187表達水平與腫癌臨床病理特征的關系

2.4上調miR-187表達對A549人非小細胞肺癌細胞增殖及細胞周期的影響 結果（見圖3）顯示，與Blank組和NC組比較，20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L miR-187 mimics轉染各實驗組的A549細胞增殖均明顯受到抑制，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。miR-187 mimics轉染24 h、48 h和72 h等不同的時間點之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。細胞周期檢測結果（見圖4）顯示，與Blank組和NC組比較，miR-187 mimics各濃度組轉染的A549細胞周期分布在24 h、48 h和72 h均發(fā)生改變，G0/G1期細胞比例增高，G2/M期細胞比例明顯降低（P＜0.05），但未見明顯的時間效應和濃度效應。

圖3　miR-187 mimics干預對A549細胞活力的影響

3　討論

miRNA是近年來在多種真核細胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼蛋白的短序列（21～23個核苷酸）RNA片斷。它通常與靶基因的3’UTR區(qū)互補配對，指導miRNA復合體對靶基因mRNA進行切割或者翻譯抑制，抑制基因表達［7-9］。自從Calin等［8］首次報道m(xù)iRNA異常表達與腫瘤有關，近十幾年來，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視。

越來越多的證據(jù)表明，miR-187可作為抑癌基因或致癌基因，與腫瘤細胞增殖和凋亡密切相關。鼻咽癌［9］、腎癌［10］、胰腺癌［11］、甲狀腺癌［12］、食管癌［13］以及神經母細胞瘤［14］等多種腫瘤，已證實存在miR-187異常表達。我們前期肺癌組織miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，miR-187在肺癌組織表達明顯下調表達。為驗證miR-187表達水平與肺癌的相關性，本研究以U6為內參照，采用RT-qPCR檢測了32例肺癌組織miR-187的表達。結果顯示，與癌旁正常肺組織比較，肺癌組織miR-187的表達明顯下調。臨床病理特征相關性分析顯示，miR-187的表達水平與肺癌病理分級及臨床分期相關。進一步細胞干預實驗證實，采用miR-187 mimics轉染上調細胞內miR-187表達后，細胞增殖明顯受到抑制，G0/G1期細胞比例增高，G2/M期細胞比例明顯降低。這些結果提示腫瘤組織低表達的miR-187可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。最近有研究［15］顯示，miR-187通過調節(jié)靶基因DAB2，參與了卵巢癌的進展，也與患者的總體生存率及術后無復發(fā)生存率相關。Mulrane等［16］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織miR-187表達水平的高、低與乳腺癌的侵襲能力相關，可以作為一個獨立的預后因素。但是不同研究者報道亦不盡相同，Cheng等［17］報道，反義抑制miR-187的表達，HeLa細胞的增殖能力下降。而Park等［18］的研究認為miR-187的過量表達，HeLa細胞的增殖能力減退，細胞凋亡增加。這些結果提示，miR-187在不同腫瘤組織可能以不同方式參與腫瘤致癌過程。

圖4　miR-187 mimics干預48 h對A549細胞周期的影響

miRNA主要通過調節(jié)靶基因表達發(fā)揮效應。Dab2［15］、MMP13［16］已被證實是miR-187的靶基因。Sirotkin等［19］研究發(fā)現(xiàn)miR-187的過度表達可以減少人類卵巢顆粒細胞凋亡相關蛋白質BAX和增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。最近Helwak等［20］基于miRNA-mRNA直接相互作用的CLASH實驗發(fā)現(xiàn)，TUBG1、MAD2L2及STOML2是miR-187的靶基因。已經證實，MAD2L2是一個參與有絲分裂檢查點過程控制的成員的基因，與癌旁正常組織比較，結腸癌組織表達明顯上調，而且MAD2L2上調表達的結直腸癌患者不良預后［21］。STOML2是Stomatin超家族成員之一，也已經證實在多種腫瘤組織上調表達［22-25］。由于miR-187在不同類型腫瘤中的作用不同，肺癌腫瘤組下調表達的miR-187是否通過上述的靶基因發(fā)揮效應還有待于進一步驗證。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect

SUN Debin， LAN Xiu. Department of Respiratory Medicine， Lishui Central Hospital， Lishui， 323000

Abstract：Objective： To explore the expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect. Methods： By normalized to U6， the expressions of miR-187 in 32 lung cancer and matched non-tumor adjacent tissue specimens were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-187 expression and clinicopathological characteristics was further analyzed. After transfected with miR-187 mimics， the biological functions of miR-187 were determined by cell proliferation and cell cycle assay. Results：Expression of miR-187 in the tissue of lung cancer was obviously higher than that in non-tumor adjacent tissue specimens （t=5.236， P＜0.0001）. Clinical features correlation analysis showed that the down-expression of miR-187 was correlated with the pathological grading and the clinical staging （P＜0.05）. Functional studies indicated that the overexpression of miR-187 dramatically inhibited the proliferation of A549 cells in vitro and changed the situation of the cell cycle， arrested at G0/G1 phase. Conclusion： Down-expression of miR-187 in the patients of lung cancer may play a key role in the development and progression of lung cancer.

Key words：microRNA； miR-187； lung neoplasms

［中圖分類號］R734.2

［文獻標志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.010

收稿日期：2015-08-19

作者簡介：孫德彬（1975-），男，浙江青田人，副主任醫(yī)師。