iNOS和VEGF在子宮內膜異位癥的表達*

李 燕，朱 君

(新疆醫科大學第五附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830000)

iNOS和VEGF在子宮內膜異位癥的表達*

李 燕，朱 君

(新疆醫科大學第五附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830000)

摘 要:目的:研究誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、血管內皮生長因子(VEGF)在子宮內膜異位癥(EMs)的異位內膜的表達。方法:采用免疫組織化學方法分別檢測30例EMs異位內膜與35例正常對照組子宮內膜組織中iNOS、VEGF的表達，了解異位內膜組織中iNOS、VEGF表達的相關性。結果:在EMs的異位內膜組織中，iNOS和VEGF蛋白的表達明顯高于正常子宮內膜組織的表達；在EMs異位子宮內膜組織中，iNOS和VEGF的表達成正相關(r= 0.895，P＜0.05)。結論:EMs中，異位內膜組織的侵襲力增強及血管生成可能與iNOS、VEGF高表達有關。

關鍵詞:子宮內膜異位癥； 誘導型一氧化氮合成酶； 血管內皮生長因子； 免疫組織化學

子宮內膜異位癥(EMs)發生發展中，一氧化氮(Nitric oxide，NO)參與其中。NO的產生需要一氧化氮合酶(NOS)的催化作用，本研究取材于EMs患者異位內膜、在位內膜及其他婦科疾病的子宮內膜，采用免疫組織化學方法檢測EMs組織中iNOS和VEGF的表達水平，研究EMs與NO及VEGF水平是否相關。

1 資料與方法

1.1研究對象:選取2012年2月至20013年10月新疆醫科大學第五附屬醫院婦科住院患者，選擇由科主任進行腹腔鏡手術探查的子宮內膜異位癥患者30例作為研究組，所有病例均根據手術所見及術后病理確診，病理切片診斷處于月經周期的增生期18例，分泌期12例；患者年齡35～48歲；對照組選用因各種良性疾病在住院期間行腹腔鏡下子宮全切術35例，術后病理切片診斷是正常子宮內膜，其中處于月經周期的增生期22例，分泌期13例；患者年齡38～51歲。研究組和對照組在患者的年齡、子宮內膜分期以及體重指數在統計學上無顯著性差異，兩組患者術前6個月內無口服性激素類藥物史及宮內節育器放置術史。

1.2方 法

1.2.1免疫組化所用試劑:兔多克隆IgG抗體iNOS，兔抗人VEGF多克隆抗體，SP免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，iNOS抗體稀釋濃度1∶200，VEGF抗體稀釋濃度為1:100。

1.2.2免疫組化檢測:在手術中采集標本，即EMs的異位子宮內膜組織和正常子宮內膜，經甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，每張約4μm厚度，一式4份。l份制作HE染色切片，3份用做免疫組化試驗。按試劑盒操作說明書進行，并且檢測VEGF及iNOS在組織的分布，對照組用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.3免疫組化圖像分析標準:采用HPIAS-1000高清晰度病理圖文分析系統，在400倍高倍鏡下觀察每個標本，隨機取5個視野，切片中細胞漿內有棕黃色顆粒為iNOS和VEGF陽性細胞，測量iNOS和VEGF陽性細胞的染色灰度，用相應背景灰度值與各測量點灰度值相減，最后的平均值作為最終灰度值，檢測光密度值(OD)以及iNOS和VEGF陽性表達面積與統計面積之比的面密度(area densities，AD)，并采用OD均值及面密度均值。

1.3統計學方法:采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，變量間的相關分析，P＜0.05，表示差異有統計學意義。應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，結果以均數±標準差表示，灰度值組間比較采用成組設計資料t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1iNOS和VEGF的表達:在正常子宮內膜組織腺上皮的表達中呈弱陽性，高倍顯微鏡下觀察可見細胞及組織著淺黃色呈散在分布；iNOS和VEGF在EMs中在位內膜組織中呈強陽性表達，主要分布在腺上皮細胞中，少量在間質，鏡下細胞呈棕黃色或棕褐色成片或灶狀分布。

表1　子宮內膜異位癥與對照組子宮內膜中iNOS和eNOS的OD值比較

2.2EMs子宮內膜組織中iNOS和VEGF的表達:iNOS和VEGF表達的面密度:試驗組EMs在位內膜組織的腺上皮及間質有片狀及灶狀強陽性iNOS和VEGF表達，而對照組正子宮內膜組織腺上皮及間質中iNOS和VEGF表達呈散在分布，兩者面密度之間比較差異均有統計學意義，見表2。

表2　比較兩組子宮內膜組織中iNOS和VEGF的面密度

2.3iNOS與VEGF表達的相關性:EMs在異位內膜組織中iNOS和VEGF呈強陽性表達，但對照組中，正常子宮內膜組織中iNOS和VEGF呈弱陽性表達，變量間的相關分析選用非參數統計方法，iNOS和VEGF表達的關聯性分析，r = 0.895，P＜0.05，表明iNOS和VEGF呈明顯正相關，在EMs中，iNOS可促進VEGF的表達，增加血管形成。

3 討 論

子宮內膜異位癥(EMs)的發病機制中“經血逆流”是主導學說，近年證實，90%女性均有經血逆流，但其中只有10%女性發生EMs[1]。說明經血逆流只是病因，而子宮內膜在腹腔內種植，血液供應的建立和支持是必不可少的，血管生成與EM的發生和發展密切相關，最重要的促血管生成因子是血管內皮生長因子(VEGF)[2]。VEGF具有促血管形成的功能[3]，VEGF是高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂原，在月經周期中，參與子宮內膜血管的形成。在病理情況下，VEGF與血管過度生成密切關系。VEGF的主要生理功能有[4，5]:①能促進細胞的有絲分裂，降解細胞外蛋白和基底膜，從而使血管內皮細胞遷移并增生。②增加血管的通透性，為血管芽延伸生長提供良好基質。③在細胞漿內，快速短暫地增加鈣離子濃度，刺激磷脂酰肌醇的磷酸化，上調信號通路的表達。

VEGF受雌激素、細胞因子、缺氧因子等調節，在眾多調節因素中，NO也參與了VEGF的調節。Kimura 等[6]發現NO具有類似低氧對VEGF的調節效應，NO與低氧誘導因子-1的結合位點結合，然后與VEGF啟動子調控元件結合，增加VEGF的轉錄，從而促進局部血管的形成，并提高組織對缺氧的耐受性。

1979年首次發現NO，NO是內源性的血管舒張因子，半衰期很短，約5～10s。體內NO的生成量取決細胞內NO前體L-Arg的跨膜轉運量與胞漿NOS的活性。它的產生需要一氧化氮合酶(NOS)的催化作用。在人體內，L -精氨酸(L -Arg)經一氧化氮合成酶(NOS)氧化生成NO，反應另一產物是L -瓜氨酸。NOS有三種同工酶，內皮型NOS(eNOS)、神經型NOS (nNOS)和誘導型NOS(iNOS)。

iNOS存在于巨噬細胞中，正常時不表達。但在EMs中，被各種細胞因子誘導，如TNF-α，IL-1等，是非Ca2+依賴的鈣結合蛋白的酶，活性維持數小時至數天，催化生成大量NO，水平高達10-6～10-9mmoL/ L水平。

根據本實驗結果，說明在EMs中，異位子宮內膜腺上皮iNOS的表達較對照組明顯增高，表明患有EMs，其異位子宮內膜合成NO水平較正常子宮內膜明顯增高，在EMs異位內膜中，iNOS和VEGF的表達呈明顯正相關。

NO增加了血管壁的通透性，使單核巨噬細胞、粒細胞系從血管內外游至血管外，形成局部炎癥，外游至血管外的單核巨噬細胞活化，經iNOS催化，不斷產生NO，同時NO不斷誘導單核巨噬細胞，兩者相互作用，使局部形成炎癥。在EMs中，NO引發的局部炎癥、上調VEGF的表達，新生血管增加，促使異位子宮內膜在腹腔種植，生長，促進EMs的進展；同時，NO代謝的產物是NO-2/ NO-3，是NO發揮生理作用的代謝途徑；另一種途徑生成過氧亞硝酸根(ONOO-)，發揮NO的毒性作用。在EMs中，iNOS增高，誘使NO表達增高，增加血管壁的通透性，形成局部炎性反應。同時，NO可上調VEGF的表達，在EMs，iNOS和VEGF相互調節，促進EMs的發生發展。因此抑制iNOS對VEGF調控，可能為EMs的治療開辟一個新的途徑。

參考文獻:

[1] Wu MY，Ho HN.The role of cytokines in endometriosis[J]. Am Reprod Immunol，2003，49(5):285～296.

[2] Barcz E，Milewski，Dziunycz P，et al.Peritoneal cytokines and adhesion formation in endometriosis: an inverse association with vascular endothelial growth factor concentration [J].Fertil Steril，2012，97(6):1380～1386.

[3] Li YZ，Li SL，Li X，et al.Expression of endogenous hypoxia markers in vulvar squamous cell carcinoma[J]. Asian Pac Cancer Prev，2012，13(8):3675～3680.

[4] Mahabeleshwar GH，Byzova TV.Angiogenesis in melanoma [J].Semin Oncol，2007，34(6):555～565.

[5] Walters EH，Reid D，Soltani A，et al.Angiogenesis :a potentially critical part of remoding in chronic airway disease[J] Pharmacol Ther，2008，118(1):128～137.

[6] Kimara H，Esumi H.Reciprocal regulation between nitric oxide and vascular endothelial growth factor in angiogenesis [J].Acta Biochim Pol，2003，50(1):49～59.

論著

Expression of iNOS and VEGF in Endometriosis

LI Yan，ZHU Jun
(The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Wulumuqi 830000，China)

Abstract:Objective:To investigate the expression of iNOS and VEGF in endometriosis(EMs).Method:Immunochemical method was used to determine the expression of iNOS and VEGF in ectopic endometrium with EMs and the endometrium of controls.Result:The expression of iNOS and VEGF in endometriosis was significantly higher than that of normal endometrium.In ectopic endometrial，the expression of iNOS and VEGF was positively related (r = 0.895，P＜0.05).Conclusion:iNOS and VEGF plays an important role in the progression of endometriosis.

Key words:Endometriosis； iNOS； VEGF； Immunohistochemistry

文獻標識碼:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.01.003

文章編號:1006-6233(2016)01-0007-03

*基金項目:新疆維吾爾自治區科技攻關和重點計劃項目，(編號:200633146-4)