丹參注射液對氧誘導幼鼠視網膜增生變性的保護作用

曹美玲，吳紅敏

(中國醫科大學附屬第一醫院，遼寧 沈陽 110001)

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丹參注射液對氧誘導幼鼠視網膜增生變性的保護作用

曹美玲，吳紅敏

(中國醫科大學附屬第一醫院，遼寧 沈陽 110001)

[摘要]目的探討丹參注射液對氧誘導幼鼠視網膜凋亡相關基因的表達及其外周血血管內皮生長因子(VEGF)的影響，以明確其抑制視網膜增生變性的作用機制。方法將100只出生7 d的SD幼鼠隨機分為對照組、模型組及丹參注射液4，2，1 g/kg組，每組20只。對照組幼鼠生活在正常氧環境下，其余4組幼鼠均制成視網膜病變模型。模型組給予腹腔注射生理鹽水，丹參注射液4，2，1 g/kg組分別給予腹腔注射相應劑量的丹參注射液，連續注射5 d后處死幼鼠，經右側眼球取靜脈血檢測VEGF濃度，取出眼球用RT-PCR法檢測視網膜中bax與bcl-2 mRNA表達水平。結果模型組幼鼠視網膜組織中bax mRNA表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，而血清VEGF濃度與視網膜組織中bcl-2 mRNA表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。丹參注射液2 g/kg組血清VEGF濃度及視網膜組織中bcl-2 mRNA表達水平均明顯低于丹參注射液1 g/kg組(P均<0.05)，高于丹參注射液4 g/kg 組(P均<0.05)；視網膜組織中bax mRNA表達水平明顯高于丹參注射液1 g/kg組(P<0.05)，低于丹參注射液4 g/kg組(P<0.05)。bax mRNA表達水平與bcl-2 mRNA表達水平間存在顯著負相關關系(r=-0.653，P<0.05)。結論丹參注射液能抑制氧誘導的幼鼠視網膜細胞增生。

[關鍵詞]早產兒視網膜病變；丹參注射液；血管內皮生長因子；凋亡

早產兒視網膜病變(ROP)的發病率有逐年上升的趨勢，盡管近年來在診斷和治療上有明顯進步，但是視網膜病變仍是主要致盲原因之一[1]。為有效治療視網膜病變，降低其發病率，揭示該病的發生機制成為目前迫切需要解決的問題。丹參注射液具有捕獲游離基、改善微循環、抑制細胞凋亡等功效，是一種抗氧化劑[2]，但是其對氧誘導視網膜增生抑制作用尚不明確。故本研究以SD幼鼠進行氧誘導視網膜病變模型的建立，探討丹參注射液對氧誘導幼鼠視網膜凋亡相關基因的表達及其外周血血管內皮生長因子(VEGF)的影響，以明確其抑制視網膜增生變性的作用機制。現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物100只出生7 d SD幼鼠由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：0034309。

1.2主要試劑丹參注射液為廣東永康藥業有限公司提供，規格：0.1 g/mL，批號：140231B；外周血清VEGF 濃度ELISA檢測試劑盒為Sigma公司產品；RT-PCR試劑盒為日本TaKaRa公司產品；Trizol試劑為美國Introgen公司產品。

1.3主要儀器ASD-310S型低溫離心機為美國Sigma公司產品；PCR儀為德國Biometra公司產品。

1.4方法

1.4.1實驗動物分組及處理將100只出生7 d的SD幼鼠隨機分為對照組、模型組及丹參注射液4，2，1 g/kg 組，每組20只。所有幼鼠均由母鼠喂養，人工控溫21～25 ℃，12 h光照，12 h黑暗。對照組幼鼠生活在正常氧環境下，其余4組幼鼠均參照文獻[3]方法制成視網膜病變模型：幼鼠于生后與同籠的2只母鼠一起裝入有機玻璃制作的密閉氧箱(一端設計為進氣孔，另一端設計為出氣孔)飼養，先將玻璃容器內氣體抽出成為真空狀態，然后接入濕潤醫用純氧氣(1.5 L/min)，氧分壓保持在75%，每2 d打開玻璃容器更換墊料加食、換水并替換母鼠。在高氧環境中飼養5 d(至出生12 d)后返回正常空氣中飼養5 d(至出生17 d)，模型組出籠后給予腹腔注射生理鹽水，丹參注射液4，2，1 g/kg組分別給予腹腔注射相應劑量的丹參注射液，均連續腹腔注射5 d(至出生17 d)。

1.4.3VEGF濃度測定經右側眼球取靜脈血用酶聯免疫法(ELISA)測定VEGF濃度，所取標本均在1 周內測定。

2結果

2.1視網膜組織中bax、bcl-2 mRNA表達水平模型組幼鼠視網膜組織中bax mRNA表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，bcl-2 mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。丹參注射液2 g/kg 組視網膜組織中bcl-2 mRNA表達水平明顯低于丹參注射液1 g/kg 組(P<0.05)，但高于丹參注射液4 g/kg 組(P<0.05)；視網膜組織中bax mRNA表達水平明顯高于丹參注射液1 g/kg 組(P<0.05)，但低于丹參注射液4 g/kg 組(P<0.05)。bax mRNA表達水平與bcl-2 mRNA表達水平間存在顯著負相關關系(r=-0.653，P<0.05)。見表1。

表1　各組視網膜組織中bax、bcl-2 mRNA

注：①與對照組比較,P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與丹參注射液4 g/kg 組比較，P<0.05；④與丹參注射液2 g/kg 組比較，P<0.05。

2.2VEGF濃度檢測結果對照組VEGF濃度為(44.67±5.78)nmol/mL，模型組為(66.78±8.31)nmol/mL，丹參注射液4 g/kg組為(53.53±5.43)nmol/mL ，丹參注射液2 g/kg組為(57.34±6.43)nmol/mL，丹參注射液1 g/kg組為(61.45±7.65)nmol/mL。模型組血清VEGF濃度明顯高于對照組(P<0.05)；丹參注射液各組血清VEGF濃度均明顯低于模型組(P均<0.05)；丹參注射液4 g/kg組和丹參注射液2 g/kg組血清VEGF濃度均明顯低于丹參注射液1 g/kg組(P<0.05)，且丹參注射液4 g/kg組明顯低于丹參注射液2 g/kg組(P<0.05)。

3討論

早產兒視網膜病變是指發生于早產兒的以視網膜血管異常增生為特征的視網膜血管疾病，而視網膜缺氧可誘導視網膜產生血管生成因子，進而刺激新生血管形成，臨床上常用ACEI類藥物來抑制其生成[4]。VEGF是連接新生血管形成各個網絡的樞紐，其與bcl-2可以相互調節促進新生血管形成[5]。bax基因本身發揮促進凋亡的效應需要與其家族中bcl-2基因相互協調形成一個調控體系，當bax同源二聚體形成時誘導細胞凋亡，而bcl-2蛋白表達量升高時，bax二聚體逐漸分開，與bcl-2蛋白形成更穩定的bax-bcl-2異源二聚體，從而抑制細胞凋亡[6]。

丹參具有抑制細胞凋亡、抗脂質過氧化和清除自由基作用，且是一種強抗氧化劑，能升高血清SOD與GSH-PX活性，并降低過氧化物活性，其可能通過打破氧自由基介導的細胞損傷，抑制脂質過氧化物與自由基生成，保護細胞膜的穩定性而達到保護細胞作用[7-9]。

氧誘導視網膜病變模型是視網膜病變和其他異常視網膜血管增生性疾病的主要模型之一，其主要依據生后第7 天小鼠的視網膜血管發育最接近早產兒視網膜血管的特點，將這種小鼠置于高氧環境中，小鼠的視網膜可出現血管增生等類似人類視網膜病變的改變而建立[3]。本實驗結果顯示，模型組幼鼠視網膜組織中bax mRNA表達水平明顯低于對照組，而血清VEGF濃度與視網膜組織中bcl-2 mRNA表達水平均明顯高于對照組。丹參注射液2 g/kg組血清VEGF濃度及視網膜組織中bcl-2 mRNA表達水平均明顯低于丹參注射液1 g/kg組，高于丹參注射液4 g/kg組；視網膜組織中bax mRNA表達水平明顯高于丹參注射液1 g/kg組，低于丹參注射液4 g/kg組；bax mRNA表達水平與bcl-2 mRNA表達水平間存在顯著負相關關系。

綜上所述，丹參注射液能抑制氧誘導的幼鼠視網膜細胞增生，對視網膜病變等視網膜新生血管疾病的治療可能具有潛在的應用前景，為視網膜新生血管疾病的治療提供了一個新的思路，但目前對其確切的作用機制還不明了，有待進一步研究。

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Protecting effect of Danshen injection on the oxygen-induced retinopathy in neonatal rats

CAO Meiling,WU Hongmin

(The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of Danshen injection on the expression of apoptosis correlated gene and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the serum in the neonatal rats with oxygen induced retinopathy,and to research the mechanism of inhibiting hyperplasia.Methods 100 neonatal rats (7-day old) were randomly divided into five groups: control group,model group, Danshen injection groups(4, 2,1 g/kg),every group included 20 rats. The rats in control group lived in the environment with normal oxygen.The rats in other groups were used to establish models of retinopathy of prematurity. Model group was given normal saline, Danshen injection groups were given 4, 2, 1 g/kg Danshen injection respectively. After intervention for 5 days, the rats were killed to draw their blood to detect the concentration of VEGF, and to get their retina to determine the expression levels of bax and bcl-2 through RT-PCR. Results The level of bax mRNA in retina tissue in model group was lower while that of bcl-mRNA was higher than that in control group(P<0.05). The content of serum VEGF and the expression of bcl-2 mRNA in 2 g/kg Danshen injection group were lower than that in 1 g/kg Danshen group (P<0.05), but higher than that in 4 g/kg Danshen injection group (P<0.05). The expression of bax mRNA in retina tissue in 2 g/kg Danshen injection group were higher than that in 1 g/kg Danshen group (P<0.05), but lower than that in 4 g/kg Danshen injection group (P<0.05). Bax mRNA expression was negatively related with bcl-2 mRNA (r=-0.653,P<0.05). Conclusion Ginkgo biloba extract can inhibit the hyperplasia induced by oxygen.

Key words:retinopathy of prematurity; Danshen injection; vascular endothelial growth factor; apoptosis

[收稿日期]2015-12-16

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)11-1174-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.010

[作者簡介]曹美玲，女，碩士，主治醫師，主要從事新生兒疾病方面的研究。[通信作者]吳紅敏，E-mail：whm406@163.com