血管內皮生長因子及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白與鼻咽癌患者臨床分期及預后的相關性

陳　彤

(甘肅省人民醫院 耳鼻咽喉頭頸外科, 甘肅 蘭州, 730000)

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血管內皮生長因子及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白與鼻咽癌患者臨床分期及預后的相關性

陳彤

(甘肅省人民醫院 耳鼻咽喉頭頸外科, 甘肅 蘭州, 730000)

摘要:目的探討血管內皮生長因子(VEGF)及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與鼻咽癌患者臨床分期及預后的相關性。方法選擇鼻咽癌患者50例及體檢健康者50例。采集鼻咽癌患者的鼻咽癌組織、癌旁正常組織以及血清標本，檢測血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD的含量以及鼻咽癌組織、癌旁正常組織中mTOR、核糖體40S小亞基S6蛋白激酶(P70S6)、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(4EBP1)的mRNA含量。結果鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量顯著高于健康志愿者(P<0.05); TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉移的鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量顯著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴結未轉移鼻咽癌患者(P<0.05)。鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達量顯著高于癌旁正常組織(P<0.05); TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉移的鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達量顯著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴結未轉移的鼻咽癌組織(P<0.05)。結論鼻咽癌患者血清中VEGF含量異常升高，腫瘤組織中mTOR表達量異常增加，VEGF及mTOR異常與TNM分期、病理分級以及淋巴結轉移相關。

關鍵詞:鼻咽癌; 血管內皮生長因子; 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白; 淋巴結轉移

鼻咽癌是中國耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤之一，其特征是較早發生頸部淋巴結轉移。鼻咽癌的發病機制仍未完全闡明，早期診斷也較為困難[1]。血管內皮生長因子(VEGF)是一類與血管和淋巴管新生相關的分子，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是與細胞生長和增殖密切相關的分子。本研究探討VEGF及mTOR與鼻咽癌患者臨床分期及預后的相關性，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2012年5月—2014年5月在本院確診為鼻咽癌的患者50例，男34例，女16例，年齡38～65歲，平均(51.24±5.32)歲；角化鱗狀細胞癌8例，非角化鱗狀細胞癌31例，未分化癌11例; TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例，Ⅳ期13例。另選取50例健康體檢者為對照。

1.2研究方法

鼻咽癌患者于術前采集外周血5 mL, 健康志愿者于體檢時采集外周血5 mL, 3 000 r/min離心10 min, 取血清待檢。鼻咽癌患者于術中采集鼻咽癌組織和癌旁正常組織，生理鹽水清洗后得到組織標本。取出血清標本，采用酶聯免疫吸附試劑盒檢測VEGFA、VEGFC、VEGFD的含量。試劑購自北京晶美生物工程有限公司。

取出鼻咽癌組織和癌旁正常組織，抽提RNA后反轉錄得到cDNA，而后進行PCR反應，擴增mTOR、P70S6、4EBP1后計算mRNA含量。具體步驟如下: ① RT-PCR引物設計。參照文獻資料，設計mTOR、P70S6、4EBP1引物。Mtor的上游5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG′, 下游5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′; P70S6的上游5′-TACTTCGGGTACTTGGTA A-3′, 下游5’-GATGAAGGGATCCTTTACT-3′; 4EP1的上游5′-ACCGGAAATTCCTGGAG-3′, 下游5′-CCCGCTTATCTTCTGTA-3′; β-actin的上游5′-ACGAGAGAATGGAAAGTCAAA -3′, 下游5′-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3′。② 總RNA提取。加入1 mL Trizol試劑于25 mL細胞培養瓶中，搖勻靜置3～5 min; 將細胞裂解液吸入1.5 mL ET管，加氯仿0.2 mL, 靜置2～3 min, 1 200 r/min離心15 min, 取上清液0.6 mL至EP管，加0.5 mL異丙醇，靜置10 min; 2 000 r/min離心10 min,，棄上清液，70%乙醇1 mL洗滌, 7 500 r/min離心5 min; 用50 μL無Rnase溶解總RNA。③ RNA濃度測定。吸取RNA溶液，加入DEPC稀釋為50 μL, 以DEPC水作參照，讀取紫外分光光度計260 nm波長下光密度值，計算mRNA濃度。④ 常規RT-PCR擴增：取1 μg RNA做逆轉錄模板, Oligo(d)T 1 μL做逆轉錄引物，加DEPC至12 μL; 75 ℃變性5 min, 冰浴冷卻；加入緩沖液4 μL, Rnase抑制劑1 μL, Dntp 2 μL, 37 ℃孵育5 min; 加入AMV逆轉錄酶1 μL, 37 ℃反轉錄60 min; 70 ℃終止反應；冰上冷卻。⑤ PCR反應條件。PCR反應體系25 μL(Cdna 0.5 μL，上游與下游引物0.25 μL, Taq酶0.2 μL，Dntp 2 μL); RT-PCR擴增條件: 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s; Mtor: 49℃30 s; P70S6K: 52 ℃ 30 s; 4EBP1：55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30個循環, 72 ℃延伸5 min, 4 ℃終止。

2結果

2.1鼻咽癌患者血清中VEGF的含量

鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量顯著高于健康志愿者(P<0.05)；TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉移的鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量顯著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴結未轉移鼻咽癌患者(P<0.05)。見表1、2。

表1　健康志愿者與鼻咽癌患者血清中VEGF的

與健康志愿者組比較, *P<0.05。

與Ⅰ/Ⅱ期比較, *P<0.05; 與高/中分化比較, #P<0.05; 與未轉移比較, △P<0.05。

2.2鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達

鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達量顯著高于癌旁正常組織(P<0.05); TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉移的鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達量顯著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴結未轉移的鼻咽癌組織(P<0.05)。見表3、4。

表3　鼻咽癌組織與癌旁正常組織中mTOR、P70S6、

與鼻咽癌組織比較, *P<0.05。

表4　不同TNM分期、分化程度及淋巴結轉移情況的鼻咽組織中mTOR、P70S6、4EBP1含量比較

與Ⅰ/Ⅱ期比較, *P<0.05; 與高/中分化比較, #P<0.05; 與未轉移比較, △P<0.05。

3討論

血管內皮生長因子(VEGF)是一類血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD等多種亞型[2]。研究[3]證實，VEGFA、VEGFC、VEGFD這3種VEGF分子與淋巴管的新生相關。本研究中，鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量顯著高于健康志愿者，提示血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量升高與鼻咽癌的發生有關。

VEGFA是功能最為明確的促血管新生的細胞因子，一方面能夠與VEGFR1結合來促進內皮細胞分裂和增殖，誘導癌細胞生長和轉移；另一方面，其能夠與淋巴管上的VEGFR2結合來增加新生淋巴管數目，促進癌細胞發生淋巴轉移。VEGFC/D能夠與VEGFR2結合來發揮促進淋巴管新生的作用，且由VEGFC/D誘導產生的新生淋巴管具有無瓣膜功能、淋巴清除率低等特點，有利于癌細胞的淋巴轉移[4]。本研究探討VEGF與鼻咽癌病情發展的關系，結果顯示TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉移的鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量顯著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴結未轉移的鼻咽癌患者，說明血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量升高與鼻咽癌的病情發展有關。

鼻咽癌發生淋巴結轉移不僅依賴淋巴管的新生過程，同時還需要腫瘤細胞自身不斷生長、增殖、分化[5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是哺乳動物體內一類高度保守的絲氨酸-蘇氨酸激酶，位于PI3K/AKT信號通路下游，主要依靠P70S6和4EBP1來調節細胞生長和增殖相關蛋白的表達[6]。組織對鼻咽癌組織中mTOR及下游P70S6、4EBP1的表達量進行分析，結果顯示鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達量高于癌旁正常組織，TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉移的鼻咽癌組織中mTOR、P70S6、4EBP1的表達量高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴結未轉移的鼻咽癌組織，提示mTOR通路功能增強與鼻咽癌的發生發展密切相關。

參考文獻

[1]武要洪, 李寶忠, 李國萍, 等. 鼻咽癌患者EBV感染與血管生成關系研究[J]. 實用臨床醫藥雜志, 2011, 15(5): 12.

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Correlation between vascular endothelial growth factor,mammalian target of rapamycin and clinical stage,prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma

CHEN Tong

(DepartmentofE.N.T. &H.N.Surgery,GansuProvincialPeople′sHospital,Lanzhou,Gansu, 730000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the correlation between vascular endothelial growth factor (VEGF), mammalian target of rapamycin (mTOR) and clinical stage, prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma. MethodsFifty patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) and fifty healthy volunteers were selected. Nasopharyngeal tissues, adjacent normal tissues and serum samples of NPC patients were collected. Serum VEGFA, VEGFC, VEGFD contents and mRNA contents of mTOR, P70S6, 4EBP1 in nasopharyngeal tissues, adjacent normal tissues were detected. ResultsSerum VEGFA, VEGFC and VEGFD contents in NPC patients were significantly higher than those in the healthy volunteers (P<0.05). Serum VEGFA, VEGFC, VEGFD contents in NPC patients with TNM Ⅲ/Ⅳ stage, low/undifferentiated, lymph node metastasis were significantly higher than those in NPC patients with TNM Ⅰ/Ⅱ stage, medium/high differentiated, without lymph node metastasis nasopharyngeal carcinoma (P<0.05). Expressions of mTOR, P70S6 and 4EBP1 in nasopharyngeal carcinoma tissue were significantly higher than those in the adjacent normal tissues (P<0.05), and mTOR, P70S6, 4EBP1 expressions in nasopharyngeal carcinoma tissues featured by TNM Ⅲ/Ⅳ stage, low/undifferentiated, lymph node metastasis were significantly higher than those in nasopharyngeal carcinoma tissues featured by TNM Ⅲ/Ⅳ stage, low/undifferentiated, lymph node metastasis (P<0.05). ConclusionSerum VEGF level and mTOR expression increase abnormally in patients with nasopharyngeal carcinoma and tumor tissue respectively, and VEGF and mTOR abnormalities are correlated with TNM stage, histological grade and lymph node metastasis.

中圖分類號:R 739.63

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-058-03

DOI:10.7619/jcmp.201607017

收稿日期:2015-12-23

KEYWORS: nasopharyngeal carcinoma; vascular endothelial growth factor; mammalian target of rapamycin; lymph node metastasis