蟾衣提取物對大鼠佐劑性關節炎的治療作用

陳錫赟，王恒，余躍生，陳燕，賀勇，張玲敏，許鍵煒,3 (黔南民族醫學高等專科學校藥理學教研室，貴州都勻 558003；貴州醫科大學藥理學教研室；3貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心)

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蟾衣提取物對大鼠佐劑性關節炎的治療作用

陳錫赟1，王恒1，余躍生1，陳燕2，賀勇2，張玲敏2，許鍵煒2,3(1黔南民族醫學高等專科學校藥理學教研室，貴州都勻 558003；2貴州醫科大學藥理學教研室；3貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心)

摘要：目的 觀察蟾衣提取物對大鼠佐劑性關節炎(AA)的治療作用。方法將60只SD大鼠隨機分為治療組、模型組和對照組各20只。模型組和治療組于每只大鼠右后足跖皮內一次性注射0.1 mL 弗氏完全佐劑，對照組注射等量的生理鹽水。治療組造模3周后按2 mL/kg腹腔注射蟾衣提取物，1次/d，連續給藥3周，模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水。在造模當天及造模后第1、2、3、4、5、6、7周分別測量大鼠體質量、左右后爪體積，各組大鼠在治療第4周后行四肢關節X線攝片檢查及四肢關節病理檢查，觀察大鼠不良反應發生情況。結果與對照組相比，模型組造模后3、4、5、6、7周左、右后爪體積大(P均<0.05)。與模型組相比，治療組造模后5、6、7周左、右后爪體積小(P均<0.05)。X線檢查結果顯示，治療組大鼠后肢爪關節與對照組相似，較模型組骨質疏松、骨質破壞明顯修復，關節面光滑，周圍軟組織影增厚減輕。HE染色結果顯示，治療組足趾關節面較光滑，增生不明顯，炎癥細胞浸潤明顯減輕，關節間隙出現，邊緣骨質破壞不明顯，與對照組相似。各組大鼠未見明顯不良反應。結論蟾衣提取物可有效減輕并修復大鼠AA所致的損傷。

關鍵詞：蟾衣提取物；佐劑性關節炎；類風濕性關節炎；實驗動物模型

目前，類風濕性關節炎(RA)[1～3]采用的非甾體類抗炎藥治療僅能使患者的癥狀得到一定緩解，但不能有效地阻斷RA的發生發展，而且長期使用該類藥物還會出現一系列不可避免的不良反應。因此，尋找療效更好、副作用更少的藥物成為醫藥工作者追求的目標。一些中藥、民族藥在治療RA方面有獨特的優勢。蟾衣，又稱蟾蛻，含蟾蜍二烯醇化合物，包括蟾蜍毒素、蟾蜍內酯類、蟾毒配質等[4,5]。近年來研究[6,7]發現，蟾衣中所含的蟾毒內酯、蟾毒素等有解毒、消腫、止痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射以及調節免疫、調節內分泌等作用，能有效改善人體內環境，促進人體代謝平衡。弗氏完全佐劑(FCA)是由抗原水溶液與石蠟油、羊毛脂和分枝桿菌按一定比例混合成的強免疫制劑，采用FCA可建立與臨床RA類似的動物疾病模型[8]。本研究采用蟾衣提取物治療FCA誘導的佐劑性關節炎(AA)大鼠，為臨床RA的治療提供實驗理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物及儀器Sprague Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半，5周齡，體質量(100±20)g，由第三軍醫大學大坪醫院動物中心提供，貴陽醫學院實驗動物中心代購，合格證號：SCXK(軍)2012-0011。蟾衣由貴州省開陽縣龍崗鎮立京村蟾蜍養殖戶董英奎友情饋贈；FCA(美國Sigma公司)；水浴鍋(泰斯特DK-98-HA型四孔，天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(EYELA OSB-2100型，東京理化)；2100型數字式口腔X線機(法國Kodak公司)。

1.2蟾衣提取物的制備參照文獻[9]并加以改進，將干燥的蟾衣粗粉200 g，以10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，靜置，析出沉淀，過濾，濾液濃縮得到浸膏2.28 g，得率為1.14%。

1.3AA大鼠模型的制備及蟾衣提取物用法所有大鼠適應性飼養2 d后，按照隨機數字表法將大鼠分為治療組、模型組和對照組各20只。醫用酒精棉球局部消毒，模型組和治療組于每只大鼠右后足跖皮內一次性注射0.1 mL FCA[3]，對照組注射等量的生理鹽水。治療組造模3周后即第21天，按2 mL/kg腹腔注射蟾衣提取物(以1%濃度溶于生理鹽水)，1次/d，固定注射時間點，連續給藥3周。模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4觀察方法觀察各組大鼠的生命體征。在造模當天及造模后第1、2、3、4、5、6、7周分別測量大鼠體質量、左右后爪體積。爪體積的測量采用排水法，即用一特制量筒，灌滿水后，將大鼠爪插入，以大鼠踝關節突出部位作為標記，使其處于水平面，用一燒杯收集測量從量筒側口排出的水量(mL)，即為所測大鼠爪的體積[10]。各組大鼠在治療第4周后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉后行四肢關節X線攝片檢查(采用口腔科移動式牙片X光機，電壓、電流與曝光時間分別設定在60 kV、7 mA和0.10 ms)[10]，之后頸椎脫臼法處死大鼠，行四肢關節病理檢查。治療前后全程觀察大鼠不良反應發生情況。

2結果

各組大鼠在實驗過程中生命體征平穩，造模后大鼠活動、食量較造模前以及正常組減少，毛色晦暗，關節腫脹逐漸加重，各組大鼠體質量、左右后爪體積比較見表1～3。影像學檢查發現，模型組大鼠后肢足趾關節骨端出現骨質疏松，有鋸齒狀改變，關節面模糊，邊緣骨質破壞；關節間隙狹窄，周圍軟組織腫脹；治療組大鼠后肢足趾關節與對照組相似，較模型組骨質疏松、骨質破壞明顯修復，關節面光滑，周圍軟組織影增厚減輕。病理切片HE染色顯示，模型組大鼠關節滑膜明顯增生，滑膜內有大量炎癥細胞浸潤，局部侵蝕到軟骨中，腔隙消失，甚至纖維化；治療組足趾關節面較光滑，增生不明顯，炎癥細胞浸潤明顯減輕，出現關節間隙，邊緣骨質破壞不明顯，與對照組相似。各組大鼠未見明顯不良反應。

表1　各組大鼠體質量比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

表2　各組大鼠右后爪體積比較±s)

注：與模型組比較，*P<0.05。

表3　各組大鼠左后爪體積比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

3討論

RA所致的關節破壞誘發的關節疼痛、晨僵以及很高的致殘率嚴重影響人類的健康和生活質量。傳統的西醫治療多數僅能緩解癥狀，而難以治愈。且有部分復發性、難治性RA患者對傳統治療反應差，臨床療效不滿意。而長期病情活動的后果則是失去勞動能力和縮短生存期[2]。

RA的發病機制尚不十分明確，可能與免疫功能紊亂所致的自身免疫性炎癥相關。雖然沒有確認引發RA的具體抗原，但多種內、外源性抗原可能均不同程度參與了RA的發生。關節組織損傷和細胞凋亡釋放的自身抗原未被免疫系統適應，進而被產生的特異性抗體結合。RA存在著促炎細胞因子和抑炎細胞因子的失衡。RA患者的關節中存在大量CD4+T細胞的浸潤，分泌的細胞因子如TNF-α誘導內皮細胞表達黏附分子，促進白細胞在血管內皮的黏附滲透，同時局部成纖維細胞生長因子的釋放促進了血管翳的形成；另外還可促使巨噬細胞、軟骨細胞以及纖維母細胞等產生IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、基質細胞衍生因子1等誘發炎癥反應，并進一步促進了淋巴細胞由血管內向滑膜的遷入、活化，軟骨細胞、滑膜母細胞分泌的前列腺素E2和膠原酶還能增強腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1的效應，參與RA的發生發展過程，加重組織損傷[11，12]。自身反應性B細胞也參與RA的發生。B細胞被激活后，產生類風濕因子、IL-6和TNF-α，還可誘導其向漿細胞分化，參與RA的發病[13,14]。蟾衣中的活性物質可下調炎癥相關轉錄因子NF-κB核轉位，抑制NF-κB激活，進而抑制上述各種炎癥介質來發揮抗炎作用[5]。

中醫認為RA屬痹癥，體虛感邪、風寒濕邪是發生本病的內、外因素，經絡痹阻是主要病機[15]。蟾衣性涼，味辛，有微毒，具有扶正固本、攻堅破瘀、消腫祛癌等作用[16]，能有效增強人體體質和免疫功能，促進生命代謝自然平衡，可用于包括各種炎癥及腫瘤在內的許多疾病的治療[4]。本研究選用貴州純天然無污染飼養環境中獲得的一級蟾衣提取物腹腔注射治療與人RA類似的大鼠AA，此給藥途徑能盡可能避免首關消除效應帶來的生物利用度下降，最大程度地發揮藥效。最終本實驗證實蟾衣提取物能有效抑制AA大鼠的病情進展，修復病損組織，這將為自身免疫性疾病乃至其他疾病的治療提供新的思路。

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(收稿日期：2015-11-12)

中圖分類號：R593.22

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.011

通信作者：許鍵煒(E-mail： 363912577@qq.com)

基金項目：貴州省中醫藥管理局中醫藥、民族醫藥科學技術研究課題計劃(QZYY2013-91)；黔南醫專科研基金項目(QNYZ201412)。