食管癌變進程中HGF、c-met、VEGF蛋白的表達變化及意義

徐志彬，馮軍波，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊050011; 2 寧晉縣婦幼保健院)

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食管癌變進程中HGF、c-met、VEGF蛋白的表達變化及意義

徐志彬1，馮軍波2，袁麗1，鄭秀麗1，王士杰1，吳明利1

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊050011; 2 寧晉縣婦幼保健院)

摘要：目的研究從正常食管→食管癌前病變→早期食管癌→進展期食管癌過程中，處于不同病變階段上皮或間質中HGF、c-met及VEGF蛋白的表達變化及意義。方法 免疫組化法檢測HGF、c-met及VEGF蛋白在正常食管組織20份、低級別上皮內瘤變組織30份、高級別上皮內瘤變組織50份、早期癌組織25份、進展期癌組織25份中的表達。抗體CD34標記血管內皮細胞，測算微血管密度。結果正常食管低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、早期癌變、早期癌、進展期癌上皮組織中，HGF蛋白陽性表達率依次為0(0/20)、3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、60%(15/25)；在間質中的陽性表達率依次為0(0/20)、0%(0/30)、30%(15/50)、52%(13/25)、76%(19/25)；在食管病變上皮中c-met蛋白陽性表達率依次為0(0/20)、10%(3/30)、30%(15/50)、36%(9/25)、56%(14/25)；在間質中VEGF蛋白陽性表達率依次為0(0/20)、3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、52%(13/25)；MVD值分別為12.33±1.68、15.72±1.97、20.91±2.20、26.42±1.96、30.01±2.35。5種組織中，HGF、c-met、VEGF蛋白的表達及MVD值差異有統計學意義(P均<0.01)。結論 隨食管癌變進展，食管上皮組織中HGF、c-met及間質中VEGF蛋白表達均明顯升高，HGF/c-met蛋白通路可刺激間質成纖維細胞分泌VEGF蛋白，促進間質微血管形成，加速癌的進展。

關鍵詞：食管腫瘤；癌相關纖維母細胞；肝細胞生長因子；c-met；血管內皮生長因子

肝細胞生長因子(HGF)主要由活化的間質成纖維細胞(常以α-SMA+為標志)分泌，它的生物學活性是由原癌基因c-met編碼的受體蛋白介導實現的[1]。已證實HGF/c-met通路與腫瘤的生長和浸潤轉移密切相關[2~4]。HGF、c-met蛋白在食管癌組織中的表達已有報道，且被發現與患者的預后密切相關，但在食管癌變動態進程中，尤其是在癌前病變階段，該通路與食管病變相關性的研究尚未見報道，且它們與VEGF蛋白的共同表達是否可促進腫瘤的血管形成仍未有定論。本文進行了相關探討。現報告如下。

1資料與方法

1.1 臨床資料選取本院2006年1月～2012年12月行內鏡黏膜切除術后所得的150例食管癌前病變及食管早期癌患者標本，男84例、女66例，年齡48～76歲。入選標本中低級別上皮內瘤變30份(低級別上皮內瘤變組)、高級別上皮內瘤變50份(高級別上皮內瘤變組)、早期癌25份(早期癌組)。同時隨機選取2011年1~12月食管進展期癌患者的組織蠟塊25份(進展期癌組)，患者男13例、女12例，年齡56~76歲；賁門癌患者手術治療后的陰性上殘正常食管組織20份(正常組)，患者男9例、女11例，年齡56~66歲。各組患者年齡、性別均衡可比。

1.2組織HGF、c-met及VEGF蛋白的檢測采用免疫組織化學一步法。用已知陽性的人癌組織切片作陽性對照；以PBS液代替一抗作陰性對照。α-SMA鼠抗人單克隆抗體和CD34鼠抗人單克隆抗體由北京西雅金橋生物技術有限公司提供；HGF兔多抗IgG、c-met兔單克隆抗體、VEGF兔多克隆抗體，由美國Bioworldtechnology公司提供。

判斷標準：按照王立峰等[5]的標準，以間質成纖維細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞，觀察5個具有代表性的高倍視野(×400)，根據陽性范圍：無明顯陽性細胞為-，局灶陽性者判定為+，彌漫陽性者判定為++，為便于統計，將+和++合并為陽性。上皮中細胞質及細胞膜中出現棕黃色顆粒為陽性細胞，在染色均勻的區域，選取5個高倍鏡視野(×400)，根據陽性細胞所占百分比，<1/3為陰性表達，≥1/3為陽性表達。

1.3微血管密度(MVD)值的測算 參照Maeda等[6]的方法，先在100倍視野下觀察CD34陽性染色的微血管高密度區，即熱點區，在400倍視野下觀察，凡與周圍細胞和結締組織成分有明顯區別的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為一個微血管；管腔直徑>8個紅細胞或肌層較厚的血管均不計數。記錄3個高倍視野下的微血管數值，取平均值作為每例的MVD值。

2結果

2.1各組α-SMA蛋白的表達α-SMA在正常食管組織成纖維細胞基本無表達(0/20)，僅在平滑肌細胞和血管平滑肌細胞中表達；低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組、早期癌組、進展期癌組間質中α-SMA陽性表達率分別為10%(3/30)、36%(18/50)、60%(15/25)、92%(23/25)；陽性細胞呈梭形或條帶樣，主要存在于癌前病變或癌巢周圍間質中，在進展期癌時密集呈條索狀包裹著癌巢。各組α-SMA陽性表達率差異有統計學意義，與正常組比較，低級別上皮內瘤變無統計學差異，高級別上皮內瘤變、早期癌及進展期癌組差異均有統計學意義(P均<0.01)。

2.2各組HGF蛋白的表達HGF蛋白表達主要定位于上皮基底層細胞及異型細胞、癌細胞及癌旁纖維母細胞，胞質著色。正常組、低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組、早期癌組、進展期癌組上皮HGF陽性表達率分別為0(0/20)、3(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、60%(15/25)。正常組、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變組、早期癌組、進展期癌組間質中HGF陽性表達率分別為0(0/20)、0(0/30)、30%(15/50)、52%(13/25)、76%(19/25)。組間比較差異統計學意義(間質χ2=36.44，上皮χ2=31.81，P均<0.01)。

2.3各組c-met蛋白的表達 c-met蛋白只表達于上皮，正常、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、早期癌、進展期癌組上皮中，c-met陽性表達率分別為0(0/20)、10%(3/30)、30%(15/50)、36%(9/25)、56%(14/25)。組間比較差異有統計學意義(χ2=23.52.81，P<0.01)。

2.4各組VEGF蛋白的表達VEGF在間質成纖維細胞的表達定位于細胞質，正常食管為陰性表達，在低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組、早期癌組、進展期癌組VEGF陽性表達率分別為3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、52%(13/25)，組間比較差異有統計學意義(χ2=20.17，P<0.01)。

2.5各組微血管密度MVD比較正常食管和低級別上皮內瘤變組織中血管少，形態規則，而進展期癌血管明顯增高，管腔大小不一，分布雜亂。正常組、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、早期癌、進展期癌組MVD值分別為12.33±1.68、15.72±1.97、20.91±2.20、26.42±1.96、30.01±2.35，組間比較，F=251.327，P=0.000。

3討論

腫瘤由實質和間質構成，間質微環境在腫瘤的發生、發展中所起的重要作用已被大家熟知，微環境中主要的細胞成分——癌相關纖維母細胞(CAFs)對于促進上皮細胞的惡性轉變起至關重要作用。CAFs是活化的間質纖維母細胞，α-SMA陽性表型是其活化標志之一。CAFs功能復雜，可分泌多種金屬蛋白酶降解基質，促進癌細胞的遷徙；分泌多種生長因子，促進上皮細胞增殖。HGF是活化的CAFs能夠大量分泌表達的一類非常重要的生長因子，它可以促進上皮細胞分裂和生長，兼具促血管生成作用。c-met是由原癌基因編碼的蛋白產物，具有酪氨酸激酶活性，廣泛分布于上皮細胞膜表面，是HGF的單一受體。研究表明，HGF和c-met在多種惡性腫瘤中常共同過度表達，二者可構成異常自分泌環，持續激活信號通路，從而促進腫瘤的侵襲和生長。HGF還可通過PI3K途徑誘導VEGF的表達和分泌，后者具有強大的促腫瘤血管生成作用。

本研究顯示，在正常食管組織中，間質成纖維細胞的α-SMA表型為陰性，在從低級別上皮內瘤變→高級別上皮內瘤變→早期癌→進展期癌轉變過程中，間質成纖維細胞的α-SMA陽性表達率逐漸升高，進展期癌組織中則可見大量的CAFs，主要分布于癌團邊緣，呈團、片狀，或呈條帶狀包裹著癌巢。上述結果提示：食管癌變進程中，伴隨著上皮細胞的惡變，間質成纖維細胞也在逐步發生活化，在逐漸向CAFs轉化的同時，其數量明顯增加，說明此類細胞可能參與了食管鱗狀上皮細胞的惡性轉變。本研究還發現，隨病變進展，癌變各階段間質成纖維細胞高表達HGF，提示其可能通過旁分泌途徑參與上皮細胞的惡性轉化；同時發現，癌變各階段上皮細胞也聯合高表達HGF和c-met蛋白，由此推測，活化的間質成纖維細胞通過旁分泌HGF而與上皮細胞表面的c-met結合，使細胞外刺激由細胞表面傳入，啟動了胞質中的信號轉導通路，通過多種途徑將信號傳遞到上皮細胞核內，促進上皮細胞自分泌HGF，這種HGF再與上皮細胞自身的受體c-met結合形成自分泌環，促進腫瘤細胞自身的增殖，間質細胞來源的HGF很可能在這一過程中是一個重要的始動因素。

腫瘤的快速生長離不開豐富的血管供氧和養分。HGF是血管生成誘導劑，受到HGF活化的c-met受體可誘導骨髓內皮祖細胞向血管內皮細胞分化，刺激內皮細胞增殖和遷移。臧茹琨等研究發現，HGF陽性的食管癌組織MVD值較HGF陰性的癌組織MVD值高，且高MVD組HGF陽性率明顯高于低MVD組。VEGF是促血管生長因子，能直接刺激血管內皮細胞分裂、增殖，誘導腫瘤血管生成。研究顯示，HGF能夠直接或間接促進VEGF分泌表達，并且二者具有協同作用。本實驗結果顯示，隨食管癌變進展，食管間質成纖維細胞逐步發生活化，其表達HGF和VEGF蛋白均逐漸增高，MVD值亦逐漸增高，尤其在高級別上皮內瘤變階段，其增高尤為明顯，提示此兩種蛋白的共同分泌表達、協同作用能明顯促進間質的微血管生成。

在食管癌變進程中，伴隨著上皮細胞的惡性變，間質成纖維細胞逐漸發生了活化，功能異常活躍，間質成纖維細胞和上皮細胞表達HGF蛋白均逐漸升高，與之相似，上皮細胞表達c-met也逐漸升高，可見，隨著食管惡變，間質成纖維細胞可以旁分泌HGF蛋白，與c-met蛋白結合而促進上皮細胞的轉化和增殖，同時可間接刺激VEGF蛋白的表達，HGF與VEGF蛋白的共同表達對于促進食管病變間質微血管生成起重要作用，作為核心環節， 阻斷HGF/c-met通路有可能成為食管癌阻斷治療突破點。

參考文獻：

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[6] Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma[J]. Cancer, 1996,77(5):858-863.

Changes in levels of HGF, c-met and VEGF expression in esophageal carcinogenesis

XUZhibin1,FENGJunpo,YUANLi,ZHENGXiuli,WANGShijie,WUMingli

(1FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes in levels of HGF, c-met and VEGF of fibroblasts in different esophageal lesions from normal to precancerous lesion, then to early carcinoma and advanced carcinoma. Methods Immunohistochemistry was uesd to detect the protein expression of HGF, c-met and VEGF in 20 cases of normal tissues, 30 cases of low-grade intraepithelial neoplasia (LGIEN), 50 cases of high-grade intraepithelial neoplasia (HGIEN), 25 cases of carcinoma tissues in the early stage (CIS) and 25 cases of carcinoma tissues in the progressive stage (EA), respectively. Antibody CD34 marker was used to mark vascular endothelial cells for microvascular density detection. ResultsAs the esophageal carcinogenesis progressed, the positive expression rates of HGF protein in the esophageal epithelia were 0%(0/20), 3.33%(1/30), 26%(13/50), 36%(9/25) and 60%(15/25), respectively. The positive expression rates of HGF protein in esophageal stromal fibroblasts were 0%(0/20), 0%(0/30), 30%(15/50), 52%(13/25) and 76%(19/25). The positive expression rates of c-met protein in the esophageal epithelia were (0/20), 10%(3/30), 30%(15/50), 36%(9/25) and 56%(14/25). The positive expression rates of VEGF protein were 0(0/20), 3.3% (1/30), 26%(13/50), 36%(9/25) and 52%(13/25). Significant difference was found in the positive expression of HGF, c-met and VEGF among five kinds of tissues (χ2=36.44, 31.81, 23.52 and 20.17, respetively; all P <0.05).ConclusionsAs esophageal carcinogenesis progresses, the expression of HGF and c-met in the esophageal epithelial tissues and VEGF protein in the stromal fibroblasts is significantly increased. HGF/c-met protein pathway can stimulate interstitial fibroblasts to secrete and express VEGF protein, promote the formation of interstitial capillaries and speed up the progress of cancer.

Key words:esophageal neoplasms; cancer-associated fibroblasts; hepatocyte growth factor; c-met; wascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-09-11)

中圖分類號：R735.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0009-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.003

通信作者簡介：吳明利(1964-)，男，主任醫師，主要從事食管癌早診早治研究。E-mail：wu.ml@tom.com

作者簡介：第一徐志彬(1976-)，男，副主任醫師，主要從事食管癌早診早治研究。E-mail：xzblxh@sina.com

基金項目：河北省衛生廳醫學科學研究重點課題計劃項目(20150749)。