人參皂苷Rh2對高脂膳食大鼠心肌缺血再灌注時內皮祖細胞的影響

周　芹，王　晞，王　龍*

1.武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060；2.武漢大學心血管病研究所，武漢 430060

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·論著·

人參皂苷Rh2對高脂膳食大鼠心肌缺血再灌注時內皮祖細胞的影響

周芹1，王晞2，王龍1*

1.武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060；2.武漢大學心血管病研究所，武漢 430060

[摘要]目的觀察人參皂苷Rh2對高脂膳食大鼠心肌缺血再灌注(IR)時內皮祖細胞數量的影響。方法健康成年雄性SD大鼠，體重180~240 g，高脂飼料喂養24周后，隨機分為缺血再灌注組(GIR組)、人參皂苷Rh2組(Rh2組)、假手術組(GS組)，另設正常對照組(N組)，給予基礎飼料喂養24周。每組6只，記錄各組大鼠體重。在高脂飼養基礎上，采用結扎冠狀動脈左前降支30 min，再灌注120 min的方法建立心肌缺血再灌注模型，GS組只穿線不結扎。Rh2組大鼠于缺血再灌注前30 min腹腔注射人參皂苷Rh2 10 mg/kg，GS組、GIR組大鼠于術前30 min腹腔注射等體積生理鹽水。于再灌注120 min后處死大鼠，測定血脂水平以及血清血管內皮生長因子(VEGF)水平，流式細胞儀計數大鼠外周血內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)的數量。結果喂養24周后，與正常對照組比較，其余組大鼠體重與血脂水平均升高(P<0.05)，假手術組大鼠外周血EPCs數量與血清VEGF水平較正常對照組稍有下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與假手術組比較，缺血再灌注組與人參皂苷Rh2組大鼠外周血內皮祖細胞數量及血清VEGF水平均有升高，且人參皂苷Rh2組升高更為顯著(P<0.05)。結論人參皂苷Rh2可增加高脂膳食大鼠心肌缺血再灌注后外周血內皮祖細胞數量，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，可能與提高血清VEGF水平相關。

[關鍵詞]高脂；缺血再灌注；人參皂苷Rh2；內皮祖細胞；血管內皮生長因子

0引言

隨著人們物質生活水平的提高與飲食結構的改變，肥胖者占人群比重越來越大。伴隨而來的高脂血癥及其相關疾病的發病率呈逐年增加趨勢，其中高脂血癥是動脈粥樣硬化獨立的危險因素[1]，可加重心肌缺血及再灌注損傷，甚至能削弱麻醉藥缺血預處理的保護作用[2-3]。因此，尋找病理狀態下有效的心肌保護藥物靶點是目前研究的熱點。

心肌缺血再灌注過程中常伴有內皮功能紊亂，有研究發現，循環內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)與心肌損傷后修復、血管新生密切相關[4]。近年人參皂苷Rh2被證實具有抗肥胖與耐缺氧作用[5-6]，且對缺血心臟具有廣泛保護作用，但其對高脂病理狀態下的心肌保護作用及機制未見報道。本研究觀察人參皂苷Rh2對高脂病理狀態下大鼠心肌缺血再灌注是否具有保護作用及其對循環EPCs的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物飼養與分組健康成年雄性SD大鼠24只(購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，體重180~240 g，適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組(N組)、假手術組(GS組)、缺血再灌注組(GIR組)、人參皂苷Rh2組(Rh2組)，每組6只。正常對照組給予基礎飼料，其余3組給予高脂飼料(配方為1%膽固醇、5%豬油、10%雞蛋黃粉、0.2%丙基硫氧嘧啶、83.8%基礎飼料)，各組大鼠自由飲水，室溫20~23 ℃，12 h晝夜循環，喂養24周。

1.2藥物干預與心肌缺血再灌注大鼠模型的建立Rh2組大鼠于手術前30 min腹腔注射人參皂苷Rh2 10 mg/kg，GS組和GIR組大鼠于術前30 min腹腔注射等體積生理鹽水，GS組只穿線不結扎。心肌缺血再灌注模型建立如下：術前禁食12 h，大鼠稱重，按40 mg/kg標準，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，背位固定于實驗用木板。常規消毒、鋪巾，大鼠四肢皮下插入心電圖針形電極，BIOPAC16導生理記錄儀記錄肢體導聯心電圖。頸部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉至氣管并插管,連接小動物呼吸機(潮氣量8~10 mL/kg,呼吸頻率70次/min,呼吸比1∶1)。于胸骨左緣3~4肋間縱行切開皮膚約3 cm,逐層鈍性分離皮下、肌肉組織,鉗夾斷開左側3、4肋骨開胸,小心提起心包并剪開,充分暴露心臟。在肺動脈圓錐和左心耳之間,可見冠狀動脈左前降支(LAD)，穿一5-0帶針縫線于動脈走形下方，打松結，將表面有一凹槽的聚乙烯硬管約0.5 cm置于活結內再系緊壓于心臟表面，此時可見心尖變白，心電圖表現ST段顯著抬高或T波高聳、QRS波變高變寬(如圖1)為缺血成功。30 min后于凹槽處剪開結扎線，抽出聚乙烯硬管即可恢復血流，心尖復紅、抬高的ST段慢慢回落或QRS波幅逐漸降低為再灌注成功的標志(如圖2)。再灌注時間為120 min。

圖1　大鼠心肌缺血時心電圖表現

1.3指標測定

1.3.1各組大鼠體重與血清各指標的測定各組大鼠均喂養24周，麻醉后稱重。正常對照組直接心臟采血，其余組缺血30 min再灌注120 min后心臟采血于促凝管，靜置2 h后以3 000 r/min，離心15 min，分離血清后放4 ℃冰箱，待測。應用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平。采用ELISA法檢測大鼠血清VEGF，按試劑盒(欣博盛Rat VEGF ELISA Kit，貨號ERC103)說明書操作檢測，使用RT-2100C酶標儀測定樣品OD值后，按標準曲線換算成VEGF含量，每個樣本重復3次，取平均值。

1.3.2外周血EPCs的提取及數量的測定參照文獻[6]采用Ficoll密度梯度離心法提取大鼠外周血中的單個核細胞。大鼠心臟采血1~2 mL于EDTA抗凝管中，與PBS緩沖液1∶1等量混勻。將混勻后的血液樣本緩慢加入離心后的淋巴細胞分離液中(體積比例為2∶3)，在20 ℃以1 600 r/min離心25 min。離心后樣本分層明顯，用取樣槍小心吸取單個核細胞層(中間云絮樣白膜層)，PBS緩沖液洗滌3次去除雜質、細胞碎片后重新懸浮于0.5%的胎牛血清BSA 80 μL中，依次加入FCR封閉試劑20 μL、FITC標記的CD34與PE標記的CD133抗體各10 μL，4 ℃避光孵育30 min。再加入0.5%BSA緩沖液2 mL離心洗滌2次，去除多余未結合的抗體，最后重懸于0.5%BSA緩沖液600 μL中，待流式細胞儀(美國BD公司)分析檢測大鼠外周血EPCs數量，結果以EPCs數量占外周血單個核細胞數量的百分比表示。根據前向角散射(FSC)與側向角散射(SSC)設置第1個細胞門，在散點圖中圈選單個核細胞區域(圖3A，R1)；依據CD34異硫氰熒光素(FITC)與SSC高度設置第2個門，圈選出CD34陽性的細胞群區域(圖3B，R2)；依據CD34 FITC與CD133藻紅蛋白(PE)設第3個細胞門，圈定CD34和CD133雙陽性的細胞群區域，即大鼠外周血EPCs(圖3C，右上象限)。

圖2　大鼠心肌再灌注時心電圖表現

圖3　大鼠外周血EPCs流式細胞儀檢測圖像

2結果

2.1各組大鼠體重與血脂水平的比較各組大鼠體重及血脂水平見表1。24周前各組大鼠體重差異無統計學意義。喂養24周后，與正常對照組相比，其余各高脂喂養組大鼠體重明顯增加，血脂水平均有升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠外周血EPCs數量的比較與正常對照組比較，假手術組大鼠外周血內皮祖細胞數量較正常對照組有所下降，人參皂苷Rh2組則明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，缺血再灌注組與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，缺血再灌注組與人參皂苷Rh2組大鼠外周血內皮祖細胞數量均有升高，且Rh2組升高更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

表1　各組大鼠體重情況與血脂水平

注：*與正常對照組比較，P<0.05

圖4　各組大鼠外周血EPCs數量

△與缺血再灌注組比較，P<0.05

2.3各組大鼠血清VEGF水平的比較正常對照組、假手術組、缺血再灌注組及人參皂苷Rh2組大鼠血清VEGF含量分別為(37.75±0.74)、(22.11±0.87)、(40.47±0.92)、(80.23±7.97) pg/mL。與正常對照組比較，假手術組血清VEGF水平下降，缺血再灌注組與人參皂苷Rh2組血清VEGF水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與假手術組比較，缺血再灌注組與人參皂苷Rh2組大鼠血清VEGF水平均有升高，且人參皂苷Rh2組升高更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5　各組大鼠血清VEGF水平

△與缺血再灌注組比較，P<0.05

3討論

近年來肥胖病理狀態的危害是諸多學者關注的焦點，其產生的危害主要通過脂質在組織、細胞內蓄積以及脂代謝紊亂，導致包括內皮細胞、單核細胞在內的多種炎癥細胞激活，進而引起血管內皮細胞及器官實質細胞功能障礙，且與致死性心血管疾病的發病密切相關[7]。營養過剩、高脂飲食與肥胖導致毒性脂質在心臟沉積過多，導致相關缺血性心血管疾病發病率呈逐年增加趨勢，而隨著介入、溶栓治療的廣泛開展，伴隨而來的心肌缺血再灌注損傷也引起了學者們的注意。許多研究表明，缺血再灌注損傷的主要機制與內皮細胞損傷密不可分，盡管內皮細胞損傷并不是心肌梗死的起因，但其功能紊亂卻加重心肌梗死區的擴大，促進心功能惡化。因此，保護內皮細胞功能成為減輕缺血再灌注損傷的關鍵[8]。

EPCs是血管內皮細胞的前體細胞，可表達干細胞以及內皮細胞的相關抗原，研究發現，EPCs通過參與內皮細胞修復及血管的再內皮化而促進血管新生[4]，在心血管病變的發生與發展中具有重要作用。循環內皮祖細胞于1997年被首次報道,隨后有關EPCs的研究日益增多，其在發生血管損傷時，可由骨髓動員至外周血，遷移、黏附到損傷相關區域，然后增殖、分化為成熟的內皮細胞，實現損傷血管再內皮化，維持內皮細胞的單層性以及完整性，從而起到修復損傷血管內膜的作用。目前研究觀點認為，EPCs不僅參與胚胎血管生成，也參與出生后的血管發生及損傷內皮的修復過程[9]。正常狀態下，循環中的EPCs分化為內皮細胞來修復受損的內皮，從而保持血管內皮層的完整[10]，一旦EPCs數量及功能受損，內皮損害和修復之間的平衡被打破，內皮層的完整性即遭到破壞。

血脂濃度長期異常，可損傷心血管內皮細胞，進而使內皮依賴性血管舒張功能減弱，導致冠狀動脈痙攣，加速動脈粥樣硬化的發生，加重心血管疾病的發展。動物研究發現，心肌缺血再灌注時，高脂動物心肌梗死面積增加，對缺血再灌注損傷的耐受性降低[5,11-12]。本研究中，正常SD大鼠攝入高脂飲食24周后產生明顯代謝障礙，表現為體重及血脂水平明顯上升，且高脂假手術組大鼠外周血EPCs數量較正常對照組大鼠減少，說明高脂狀態下循環EPCs數量降低，與其他學者研究結果一致[1]。EPCs數量的降低，血管內膜損傷及修復功能減弱也許能解釋高脂大鼠心肌缺血再灌注損傷較正常大鼠更為嚴重的原因。

人參皂苷Rh2的化學名為原人參二醇-3-氧-B-D-吡喃葡萄糖苷，最早在1983年由紅參中提取出來。早期研究大多證實其具有較強的抗腫瘤活性，且對正常細胞毒性較小。隨著學者對人參皂苷Rh2研究的深入，發現該皂苷具有其他的藥理活性，包括抗炎、抗肥胖及耐缺氧作用[5]。在體及離體研究[13]發現，人參皂苷Rh2對阿霉素誘導的心肌毒性具有保護作用，包括減少心肌損傷相關酶的釋放，拮抗抗氧化分子的減少，并改善心肌脂質過氧化物丙二醛的積累。最近有研究表明，人參皂苷Rh2能夠明顯促進人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移及管腔結構形成，具有促進血管新生作用[14]。本研究在大鼠高脂模型的基礎上，建立心肌缺血再灌注模型，再給予人參皂苷Rh2腹腔注射干預后觀察大鼠外周血EPCs數量的變化，探討其保護作用。對比發現心肌缺血再灌注可促使外周血EPCs數量增多，可能與心肌缺血再灌注損傷后EPCs骨髓動員相關。本研究發現，給予人參皂苷Rh2腹腔注射干預后，外周血EPCs數量升高更為明顯，提示人參皂苷Rh2可起到內皮修復及保護受損心肌的作用。

血管內皮生長因子(VEGF)是生長因子家族成員，是血管新生的調控因子。研究發現，VEGF可誘導EPCs向成熟內皮分化，促進血管內皮細胞增殖及血管形成[15]。在組織缺血情況下，外周血VEGF水平升高，促進EPCs的動員、分化及歸巢，參與血管新生過程[16]，在EPCs的調節機制中具有重要作用。近年王偉等[17]研究發現，通過腺病毒載體轉染VEGF165基因，可以促進內皮祖細胞分泌VEGF，提高內皮祖細胞的增殖能力，表明VEGF對EPCs具有調控能力。本研究發現，各組大鼠血清VEGF的變化與外周血EPCs數量變化趨勢基本相同。高脂假手術組大鼠血清VEGF水平較正常對照組大鼠降低，缺血再灌注組與人參皂苷Rh2組血清VEGF含量升高，且后者升高明顯。這提示高脂大鼠外周血EPCs的降低可能與血清VEGF的降低相關，心肌缺血再灌注能提高血清VEGF水平，而人參皂苷Rh2提高心肌缺血再灌注高脂大鼠外周血EPCs數量，可能與其明顯升高血清VEGF水平相關。

然而外周血EPCs的鑒定方法至今仍未統一，本實驗采用密度梯度離心提取外周血單個核細胞后，以CD34與CD133雙標記僅可代表一部分EPCs水平，有關EPCs的鑒定仍需進一步完善。加之有關EPCs的調節機制眾多，包括細胞因子、氧化應激等。人參皂苷Rh2通過何種機制提高血清VEGF水平，動員EPCs，是否還具有其他調節作用及保護作用及其機制如何還需進一步研究。

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Effect of ginsenoside Rh2 on endothelial progenitor cells number of high fat diet rats with myocardial ischemia-reperfusionZHOU Qin1,WANG Xi2,WANG Long1*(1.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of ginsenoside Rh2 on endothelial progenitor cells(EPCs) number of high fat diet rats with myocardial ischemia-reperfusion (IR).MethodsHealthy adult male SD rats weighing 180~240 g with high fat diet for 24 weeks,were randomly divided into three groups:ischemia-reperfusion group (GIR group,n=6),ginsenoside Rh2 group(Rh2 group，n=6) and sham operation group(GS group,n=6).Another rats were fed with basic diet for 24 weeks as normal control group(N group,n=6). The weight of rats in each group was recorded. Based on the high fat diet,the myocardial ischemia-reperfusion model was established by ligated left anterior descending coronary artery for 30 min and 120 min for reperfusion. The rats in GS group were operated without ligation. The rats in Rh2 group was intraperitoneal injected ginsenoside Rh2 at the dose of 10 mg/kg at 30 min before establishing the IR models,while rats in GIR group and GS group were treated with saline.At 120 min after reperfusion,the rats were sacrificed,serum lipid levels and vascular endothelial growth factor (VEGF) level were tested,the number of peripheral blood progenitor cells (EPCs)was counted by flow cytometry.ResultsAfter 24 weeks,compared to the N group,the body weight and serum lipid levels of rats in other groups were elevated(P<0.05),the number of peripheral blood EPCs and serum VEGF level of rats in GS group decreased (P<0.05). Compared to the GS group,the number of peripheral blood EPCs and serum VEGF level of rats in both GIR and Rh2 groups increased,and the change of Rh2 group was more significant (P<0.05).ConclusionThe ginsenoside Rh2 could increase the number of EPCs in high fat diet rats with myocardial ischemia-reperfusion potentially involving with increased serum VEGF level,which is beneficial to alleviate the myocardial ischemia-reperfusion injury.

Key words：High fat;Ischemia-reperfusion;Ginsenoside Rh2;Endothelial progenitor cells;Vascular endothelial growth factor

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601001

*通信作者

基金項目：湖北省自然科學基金項目(2014CKB497)

收稿日期：2015-06-17