睪丸特異性蛋白50在腫瘤中的研究進展

郭秋實，李冰潔 綜述，朱　濤△ 審校

(1.河南省柘城縣人民醫院檢驗科，河南商丘 476200；2.河南省平頂山學院　467000)

·綜述·

睪丸特異性蛋白50在腫瘤中的研究進展

郭秋實1，李冰潔2綜述，朱濤1△審校

(1.河南省柘城縣人民醫院檢驗科，河南商丘 476200；2.河南省平頂山學院467000)

關鍵詞:睪丸特異性蛋白50；乳腺癌；胃癌；結直腸癌；腫瘤標記

睪丸特異性蛋白50(TSP50)是利用甲基化敏感差分析技術(MS-RDA)從睪丸組織和乳腺癌組織中分離出來的低甲基化片段，其表達具有高度的特異性，在人睪丸組織中特異性高表達；肺臟、胃腸道、乳腺等正常組織均不表達。近年來的研究發現,TSP50在乳腺癌、胃癌、結直腸癌等多種腫瘤中高表達，與腫瘤的發生和發展密切相關,有望作為一種潛在的新型腫瘤標志物和藥物作用靶點應用于臨床腫瘤的診斷和治療，成為腫瘤免疫學研究的熱點。

1TSP50概述

1.1TSP50的理化特性TSP50是腫瘤/睪丸抗原(CTA)家族中的一個新成員，Shan等[1]以乳腺癌組織為材料，用對甲基化CG 豐富序列敏感的限制性核酸內切酶MSPⅠ來消化基因組 DNA 制備復制子，再通過MS-RDA在乳腺癌組織基因組中分離得到2個亞甲基化DNA片段(BR50、BR254)，再用BR50作為探針，在人體睪丸cDNA文庫里篩選到一種新的腫瘤-睪丸基因。正常情況下，TSP50在人睪丸組織中特異性高表達,肺臟、胃腸道、乳腺等組織均不表達[2]。TSP50編碼基因位于人類第3號染色體上，cDNA全長1 338 bp，含有4個外顯子，編碼一種含385個氨基酸的蛋白，其與常見的絲氨酸蛋白酶同源,但催化活性中心三聯體結構中的絲氨酸被蘇氨酸替換，因此它是一個特殊類型的蘇氨酸蛋白酶，且蘇氨酸蛋白酶活性殘基在細胞增殖中發揮重要作用[3]。TSP50基因有活性的啟動子包含CpG島和轉錄活性區,人DNA經重亞硫酸鹽處理后聚合酶鏈反應(PCR)擴增的片段為-89～-257,長度為168 bp,這個CpG島包括12個CG和TATA盒子[4]。

1.2TSP50蛋白在腫瘤中的表達與調控TSP50蛋白表達具有高度的特異性，其可能與TSP50 基因啟動子CpG 島甲基化水平有關。Huang等[4]的研究指出，正常組織中 TSP50 啟動子 CpG 島甲基化位點處于髙甲基化狀態，結合的甲基改變了 DNA 雙鏈結構的空間構象，影響了某些表達調控因子與 TSP50 啟動子的結合，TSP50 啟動子的活性降低，TSP50 基因功能保持沉默，TSP50 蛋白不表達。腫瘤組織因啟動子 CpG 島甲基化位點去甲基化，DNA 雙鏈結構的空間構象發生了改變，使某些表達調控因子能夠與TSP50啟動子的結合位點結合，啟動子被激活，TSP50基因開始轉錄，表達 TSP50 蛋白，表達 TSP50 蛋白的組織和不表達 TSP50 蛋白的組織進行的啟動子甲基化水平試驗結果與 TSP50 蛋白在這些組織中的表達結果相符，由此證明了 TSP50 啟動子 CpG 島甲基化位點的甲基化水平決定了啟動子的活性，也決定了 TSP50 蛋白在組織中的表達。關于TSP50基因表達調控機制到目前為止僅有少量研究。堿性成纖維生長因子(bFGF)可以與TSP50啟動子中的SP1結合位點,通過 ERK/SPl 通路下調TSP50表達[5]。Kosaka-Suzuki等[6]也發現，TSP50基因上有2個可以與轉錄因子BORIS蛋白結合的位點，通過與轉錄因子BORIS蛋白結合可以促進TSP50基因的表達，而結合位點的突變將導致BORIS無法結合及喪失其激活啟動子的能力。雖然BORIS的表達很重要，但它對于TSP50的表達是非常必需的，進一步的研究表明BORIS結合位點與其甲基化狀態相互獨立，同時他們的研究也在生理條件下驗證了一種CTA的表達可以被另一種CTA調控。Yu等[3]的研究發現，TSP50 T310基因突變顯著降低了TSP50誘導的細胞增殖、集落形成、離體細胞的侵襲力，最重要的是降低了TSP50在體內的致癌作用,可見TSP50蛋白T310基因在TSP50發揮生物功能中也起重要作用。進一步研究表明，其蛋白酶活性中心的三聯體結構尤其是第206位表達的天門冬氨酸，在TSP50介導的細胞增殖特別是腫瘤的發生中起的作用大于第310位表達的蘇氨酸及第153位表達組氨酸[7]。應用RNA干擾技術沉默TSP50的表達后,可以抑制腫瘤細胞的增殖、克隆形成和轉移、誘導腫瘤細胞調亡,增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物阿霉素的敏感度,其潛在分子機制與NF-κB信號途徑相關[8]。TSP50通過激活細胞核內的NF-κB信號傳導通路及P53抑癌基因的負調控在細胞的增殖中起重要作用[9-10]。研究TSP50蛋白在腫瘤中的分子機制，將使關于TSP50蛋白在腫瘤發生和發展中作用的研究更加明了。

2TSP50表達與腫瘤

2.1TSP50與乳腺癌乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據國家癌癥中心和原衛生部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發病數據顯示，全國腫瘤登記地區乳腺癌發病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發病率全國約為42.55/10萬，成為危害女性健康的第一大殺手。乳腺癌的早期發現、早期診斷是提高療效、減少病死率、改善預后的關鍵。因此新的腫瘤標志物被不斷發現病應用于乳腺癌的早期診斷。TSP50是Shan等[1]在乳腺癌組織中通過MS-RDA分離出來的特殊蛋白質，他們應用免疫印跡法檢測癌組織的研究表明，大約92%的乳腺癌患者癌組織中有TSP50蛋白表達，具有很高的陽性率；劉洋等[11]利用免疫組織化學方法，用單克隆抗體檢測了112例乳腺癌患者組織、乳腺良性腫瘤患者組織及乳腺增生患者組織中TSP50蛋白的表達情況。結果顯示，TSP50在乳腺黏液腺癌、乳腺浸潤性導管癌和乳腺單純癌3種惡性腫瘤組織中陽性率分別達到100.0%、100.0%和87.5%；而在乳腺纖維腺瘤及乳腺增生中的陽性率僅為14.6%和15.6%，陽性染色出現在腫瘤細胞中，而在腫瘤間質細胞及腫瘤周圍相對正常的組織中表現為陰性；而且早期乳癌患者TSP50蛋白表達較低。Xu等[2]研究顯示，化合物TI503通過上調乳腺癌細胞miR-937-5p 和miR-4709-3p的表達抑制TSP50蛋白的表達，進而抑制乳腺癌細胞的增殖,而土木香內酯通過下調細胞TSP50的表達誘導腫瘤細胞的凋亡，但其具體機制并不清楚[12]；由此表明，TSP50蛋白在乳腺癌中高表達，其與乳腺癌密切相關，可以作為乳腺癌特異性分子標記應用于乳腺癌的診斷，也可以作為某些抗腫瘤藥物作用的靶點，通過阻斷癌組織中TSP50蛋白的表達進而抑制腫瘤細胞的增殖而達到控制腫瘤的進展、改善患者預后的目的。

2.2TSP50與胃癌胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，雖然在過去的十幾年里，其發病率下降了約10%，但其發病率仍排在全球惡性腫瘤發病率的第4位，且其病死率排在第2位[13]。常用的腫瘤標志物如胃癌相關抗原MG7-Ag(MG7-Ag)、血清胃蛋白酶原Ⅰ(PGI)、PGⅡ等在胃癌的診斷中發揮了重要作用。而最近的研究表明，TSP50蛋白在胃癌組織同樣高表達，因此其可能在胃癌的診斷、治療及判斷預后等方面也有重大意義。茅淑硯等[14]通過研究51例胃癌患者，應用免疫組織化學染色和反轉錄-PCR檢測 TSP50蛋白在胃癌中的表達情況，結果顯示，TSP50 蛋白表達陽性45 例，陽性率為 88%。Liu等[15]應用組織微陣列技術對334例胃癌組織及對應的癌旁組織蠟塊20例的表達進行檢測的研究表明,TSP50蛋白在191例胃癌患者中呈高表達，在20例癌旁組織中均呈低表達；單因素χ2檢驗分析結果顯示，TSP50蛋白表達在年輕患者、較晚TNM分期、有淋巴結轉移的病例明顯高于年老患者、較早TNM分期和無淋巴結轉移的病例，差異有統計學意義；低表達TSP50病例中位生存年齡為38.02個月,高表達TSP50組為30.21個月；多因素Cox回歸模型顯示，TSP50蛋白表達是胃癌的獨立預后因素(P=0.017,95%CI=1.078～2.172)。TSP50蛋白在胃癌組織中表達明顯高于正常組織及癌旁組織，因此它可作為胃癌新的診斷標志物，也可以通過監測胃癌患者TSP50蛋白的水平來評估患者的TNM分期、淋巴結轉移情況及判斷患者預后，對指導治療、選擇合適治療方案意義重大。但由于研究的標本量少，有必要進行大標本、多中心的臨床驗證，以期得到TSP50蛋白在胃癌中的應用價值。

2.3TSP50與結腸癌關于TSP50蛋白在結直腸癌中的表達情況:Zheng等[16]通過RT-PCR與Western blot分析檢測 SW480、SW620、LoVo、HT-29、HCT116、LS174T 和Caco-2 等7 種人結直腸癌細胞，首次發現TSP50蛋白在結直腸癌細胞中的表達，其表達水平顯著高于結直腸腺瘤和正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，ROC 曲線評價其診斷結直腸癌的特異性、陽性預測值為92.5%、95.6%;TSP50 高表達患者的 5 年生存率為 42.8%、中位生存時間為 48個 月，而低表達患者的 5 年生存率為 73.3%、中位生存時間為 108個月。多因素Cox回歸模型同樣顯示TSP50蛋白表達是結腸癌的獨立預后因素。與此同時，任雙雙等[17]應用免疫組織化學染色技術檢測結腸癌中 TSP50 蛋白的表達結果同樣顯示TSP50蛋白在結腸癌組織中高表達，其陽性率為94%(45/48)。從以上研究可以看出，TSP50蛋白在結直腸癌中表達有很高的陽性率，并且其水平的高低與腫瘤患者的預后及生存期有很大聯系，因此，臨床上可以以檢測腫瘤患者TSP50蛋白水平來篩選高風險患者及評估患者預后，這對根據患者情況采取適當、有效的個體化治療具有很大指導意義。

2.4TSP50與喉癌喉癌是一種常見的惡性程度高的鱗狀細胞癌，雖然其發病率僅為(1.1～3.4)/10萬人，因其常伴有聲音嘶啞、呼吸困難、咳嗽和吞咽困難等多種并發癥，這就使喉癌早期診斷很困難，且因此導致其預后非常差[18]。Zhang等[19]通過應用TSP50 shRNA轉染人喉癌細胞系的HEp2細胞及敲除HEp2細胞中的TSP50基因，然后采用Western blot檢測TSP50的表達水平、MTT比色法檢測細胞的增殖、核染色法評價細胞的凋亡等，結果顯示這兩類HEp2細胞表達的TSP50顯著下調、細胞凋亡增多、且細胞的增殖和遷移也受到極大的限制。他們研究認為這可能與TSP50下調，抑制NF-κB信號傳導通路有關，此研究讓初步了解了TSP50在喉癌發生和發展中的機制及作用，提示TSP50在喉癌的發生和發展中也發揮了重要作用，為喉癌發生機制的研究提供一個新的視角，其也可能成為喉癌治療新的潛在作用靶點。

3問題與展望

TSP50在乳腺癌、胃癌、結直腸癌、喉癌等多種腫瘤的診斷中具有良好的前景，可是TSP50在腫瘤應用的研究過程中仍存在一定的問題：如TSP50蛋白到底在哪些腫瘤中表達，其在正常組織中的表達情況如何；由于生物學功能并不十分清楚，其在癌癥發生和發展中所起的作用及機制到底是怎樣的；TSP50蛋白的表達與腫瘤的分期有沒有相關性及相關性有多大等這些都需要進一步研究。目前現有的研究標本量較少，結果具有局限性，有必要擴大標本進行更多的臨床試驗來驗證；而且最重要的是腫瘤患者血清中能否也檢測到特異性的TSP50蛋白或抗體，這是作為一項腫瘤標志物能否廣泛應用于臨床診斷的關鍵，但現在鮮有文章來驗證。隨著研究的進展，Wei等[20]采用噬菌體篩選技術獲得了針對TSP50 片段的特異性單鏈抗體A1基因(scFv-A1)、scFv-A11、scFv-C8，然后把scFv-A1、scFv-A11克隆到pPELB信號肽上并在大腸埃希菌中成功表達出可溶性蛋白，得到的蛋白通過2次離子交換色譜法和固定化金屬親和層析純化后，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳得到了一個相對分子質量為31×103的蛋白條帶，經雙抗體夾心法證實成功得到TSP50蛋白的單克隆抗體。

TSP50 單克隆抗體制備的成功將使關于血清中TSP50蛋白或抗體的檢測成為現實，并且讓通過檢測血清TSP50蛋白或抗體來用于腫瘤診斷成為可能，其同樣讓學者在研究TSP50蛋白在腫瘤發病中的機制、腫瘤的免疫治療和靶向治療等方面的研究取得更大突破。

參考文獻

[1]Shan J，Yuan L，Xiao Q，et al.TSP50，a possible protease in human testes，is activated in breast cancer epithelial cells [J].Cancer Res,2002,62(1):290-294．

[2]Xu HP,Yuan L,Shan J,et al.Localization and expression of TSP50 protein in human and rodent testes[J].Urology，2004，64(4):826-832.

[3]Yu YL,BaoYL,Zhen BS,et al.The threonine protease activity of testes-specific protease 50(TSP50)is essential for its function in cell proliferation[J].PLoS One,2012,7(5):e35030.

[4]Huang Y,Wang YZ,Li YX,et al.Differential methylation of TSP50 and mTSP50 genes in different types of human tissues and mouse spermatic cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2008，374(4):658-661.

[5]Wang M,Bao YL,Wu Y,et al.Basic FGF downregulates TSP50 expression via the ERK/Sp 1 pathway [J].J Cell Biochem，2010,111(1):75-81.

[6]Kosaka-Suzuki N,Suzuki T,Suzuki T,et al.Transcription factor BORIS(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)directly induces expression of a cancer-testis antigen,TSP50,through regulated binding of BORIS to the promoter [J].Biol Chem,2011,286(31):27378-27388.

[7]Song ZB,Liu B,Li YY,et al.The catalytic triad of testes-specific protease 50(TSP50)is essential for its function in cell proliferation [J].Cell Signal,2014,26(10):2266-2275.

[8]Song ZB,Bao YL,Zhang Y,et al.Testes-specific protease 50(TSP50)promotes cell proliferation throughthe activation of the nuclear factor κB(NF-κB)signalling pathway[J].Biochem J,2011,436(2):457-467.

[9]Yuan J,Wu C,Huang M,et al.TSP50 depends on its threonine protease activity and its interactions with TNF-a-induced NF-κB for its role in human cervical tumorigenesis[J].Cell Biochem Biophys,2015，71(2):891-896.

[10]Zhou L,Bao YL,Zhang Y,et al.Knockdown of TSP50 inhibits cell proliferation and induces apoptosis in P19 cells [J].IUBMB Life,2010,62(11):825-832.

[11]劉洋,李玉新，鮑永利.TSP50單克隆抗體的制備及其與乳腺癌相關性研究[D].長春:東北師范大學，2009.

[12]Xu GM,Zheng BS,Bao YL,et al.Alantolactone induces cell apoptosis partially through down-regulation of testes-specific protease 50 expression[J].Toxicology Letters,2014，224(3):349-355.

[13]Ferlay J,Shin HR,Bray F，et al.Estimates of wordwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.

[14]茅淑硯，王悅增.胃癌中腫瘤-睪丸特異性抗原TSP50的表達及其機制的研究[D].長春:吉林大學，2012.

[15]Liu F,Cao QH,Liu N,et al.Overexpression of Testes-Specific Protease 50(TSP50)Predicts Poor Prognosis in Patients with Gastric Cancer[J].Gastroenterol Res Pract,2014,30(3):498246-498256.

[16] Zheng L,Xie GF，Li QW,et al．High expression of testes - specific protease 50 is associated with poor prognosis in colorectal carcinoma [J]．PLoS One,2011，6(7):e22203.

[17]任雙雙，王悅增.人結腸癌中 TSP50的表達及其啟動子區域的甲基化[D].長春:吉林大學，2014.

[18]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[19]Zhang X.Depression of testes-specific protease 50(TSP50)inhibits cell proliferation and induces apoptosis in laryngocarcinoma [J].Tumor Biol,2014,35(11):10781-10788.

[20]Wei J，Liu Y，Yang S，et al.Screening of single-chain variable fragments against TSP50 from a phage display antibody library andtheir expression as soluble proteins[J].J Biomol Screen,2006,11(5):546-555.

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.030

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1525-03

(收稿日期：2015-12-28修回日期：2016-02-10)

△通訊作者，E-mail：18237013803@163.com。