呼吸系統霧化基因治療研究進展

孫文武 馬壯

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·綜述·

呼吸系統霧化基因治療研究進展

孫文武 馬壯

呼吸系統疾病； 霧化治療； 基因治療

基因治療作為新的分子治療手段對人類疾病的治療有重大影響，然而基因治療的安全性和有效性是其應用于臨床治療的主要障礙[1]。呼吸系統的結構特點和生理功能使其內表面與外界環境充分接觸，這樣以霧化形式進行基因治療為呼吸道疾病治療提供了一種新的手段。這種霧化吸入性非侵入的轉基因方式逐漸被重視起來，近20年在這一領域取得了一些成果，也遇到了一些有待解決的難點。現對呼吸系統霧化吸入基因治療研究進展作一綜述。

一、霧化設備

呼吸系統霧化轉基因技術是在機體整體給藥基礎上發展而來，在呼吸系統基因霧化吸入轉染研究之初，對動物整體給予載體修飾后的基因，觀察在靜脈和呼吸道氣溶膠給藥后肺部局部的基因表達情況，發現兩種方法均可以在肺臟有基因表達，但經靜脈方式多在動脈分岔部位的血管內皮細胞表達，而霧化吸入的基因表達多在肺呼吸道上皮細胞和肺巨噬細胞表達[2-3]。Gautam等[4]研究表明霧化吸入的方式給予的轉基因方法只在肺局部有目的基因中表達，在機體其他部位沒有表達。

為了使目的基因很好地與液體一起形成氣溶膠，Lentz等[5]研究了多種霧化方法，主要包括：氣體流動噴射霧化方式、超聲波霧化方式、高頻機械震動方式和靜電射流方式等。氣流噴射式霧化機是應用壓縮后的空氣，使氣體通過溶液，使溶液在霧化小室內產生霧滴，并隨氣流飄散[6]。超聲霧化機是應用超聲的震動使溶液表面獲得能量后，霧滴飄散脫離液體表面[7]。靜電式霧化機是噴嘴處設置高壓靜電，使液滴帶電荷而飄散[8]。石英振蕩式霧化機是將液體放置在多孔小室內，經石英高頻振蕩后，在多孔噴嘴處形成霧滴，經外加流動空氣帶入患者呼吸道[9]。這些霧化手段在小分子(非基因性)藥物霧化中已取得較好的霧化治療效果，但對基因藥物的霧化效果并不理想。

在霧化過程中保持質粒類長鏈的基因藥物的完整性是影響肺轉基因治療的重要環節之一。臨床常用的是機械噴射的霧化機，其結構簡單，其他的霧化機較復雜的結構，但在基因霧化中，在保持質粒完整性環節，這些霧化機都表現出對質粒的破壞作用[10]。霧化機對基因轉染霧化應用效果的研究表明:在沒有修飾的質粒載體霧化中，氣流噴射，機械振蕩及超聲方式對質粒的完整性都有較大的破壞。并且DNA越長，分子量越大，經這些方法霧化后完整性越差[5]。而靜電噴射方式的霧化對基因破壞性要小一些[8]。另外，在霧化環節改變了基因藥物其他的理化性質也會影響霧化治療效果。首先，無論采用什么樣的霧化機或霧化手段，直接霧化的效果表現在對液滴直徑大小的影響，直徑越大的液滴，越不易飄散，而直徑小的液滴更容易進入到呼吸道末端，在肺內分散性也越好。其次，基因性藥物為質粒DNA柔性大分子，在霧化環節容易被沖擊破壞，可影響基因完整性和目的蛋白的表達。雖然霧化后產生的霧滴越小，對于肺內藥物分布效果越好，但越小的霧滴在產生過程中，DNA分子受到的沖擊力也越大，分子的完整性也越容易招到破壞。同時質粒等基因藥物，在機械性霧化機中時間越長，被霧化的次數也就越多，受破壞的機會也就越大，長鏈的片段化也就越加明顯[11]。為此兼顧兩種作用新型霧化機的研制是基因霧化治療中急需解決的問題。但無論應用什么樣的手段或儀器，霧化的效果最好是產生的霧滴越小，同時DNA破壞性越小，就越能達到臨床基因霧化需要。

在基因轉染的過程研究中，無論哪種方式對基因治療的定量問題都是難題，傳統的霧化機是將動物放入密閉的容器內或用面罩給患者進行霧化，這種方式不僅浪費，而且定量較為不準確。為此瑞典的研究組設計了氣管內給予霧化的給藥方式，采用微量霧化噴頭，經呼吸道在氣管內進行霧化，并且在短時間內(如吸氣時段期間)給予霧化，該方法不僅有節約效果，而且給予基因治療能夠定量相對精確[12]。王虹等[13]研究表明，利用這種氣道內霧化方式可提高基因轉然效率至300倍。對于病毒性載體可利用激光對溶液照射后產生蒸汽后霧化[14]。此外，霧化之后，對基因藥物顆粒的大小和表面電荷的影響也應被考慮，有可能基因完整性可以保持完好，而基因藥物的顆粒性質包括納米級粒徑和顆粒表面電勢出現變化也會影響轉染效果。

二、基因修飾物

肺臟轉基因治療載體分為病毒載體和非病毒載體。病毒類載體包括腺病毒和逆轉錄病毒。雖然病毒類載體對呼吸道內皮能進行有效轉染，但病毒類載體具有抗原性和對機體潛在的威脅，會影響其在臨床上的應用，重復使用病毒類載體會刺激機體產生抗體[15]。病毒載體對質粒大小有限制，而非病毒載體可以攜帶相對大的基因質粒[16]。但是，非病毒類基因載體必須克服物理，化學和生物性屏障，這是轉基因治療的主要障礙。非病毒性載體包括陽離子脂質體等高分子聚合物。目前，對基因載體修飾的高分子聚合物研究較為深入，已成為肺霧化基因治療的主要基因載體修飾手段。

研究發現由DOTMA和DOPE組成的脂質體可以將基因性物質導入細胞內，由于DOTMA的脂質體表面擁有正電荷，同基因等物質的負電荷結合，與生物膜接觸后可以與膜融合或內化方式將基因物質導入細胞內，DOTMA是人工合成的去垢劑，有18個炭原子、疏水鏈和一個氨基離子，摻入DOPE后可形成穩定的脂質體[17-18]。Crook等[19]發現陽離子脂質體可以應用到霧化吸入轉基因治療中，以保護基因不被核酸酶破壞。在動物肺中可以檢測到目的基因表達，但也有研究表明應用陽離子脂質體修飾的基因質粒在霧化過程中造成基因損壞。Schwarz等[20-21]發現改變陽離子脂質體多種不同組分可以增加基因藥物穩定性，從而增加基因轉染效果。Colonna等[22]研究表明陽離子脂質體包裹的干粉可以攜帶基因物質進行霧化基因治療。

另一種較為有代表性的高分子聚合物是PEI，是一種陽離子聚合物，它修飾后的基因具有在體外培養的細胞或組織中均轉染效率，因其每三個原子中有一個是質子化的氮原子，因此具有較高的緩沖能力，并且可以將基因引導入核，PEI也可以保護基因不被酶降解[23-24]。Thomas等[25]研究表明，由于這種結合很牢固，PEI/DNA復合物一同進入細胞，甚至一同進入到細胞核，乃至在細胞內的基因和高分子聚合物不能完全被分開，從而可影響細胞內的生物利用效率，因此有研究對PEI進行多種方式的修飾改造，以增加生物利用度和減少細胞毒性。不同于PEI作用機制，陽離子脂質體和基因性物質結合后，具有細胞膜的相似性特征，其部分與生物膜結合，內容物進入到細胞質中，也有部分是以內吞的形式進入細胞[26]。

三、基因載體溶液物化性質對轉基因效率的影響

在研究高分子聚合物對組織轉染效果的實驗中，發現在轉基因的溶液某些性質改變可以影響轉染效率，如改變溶液的酸堿度可以影響基因轉染效率， pH值可能改變高分子聚合物和基因復合物顆粒的表面電勢，從而影響復合物與細胞表面的關系[27]。也有研究表明低滲透壓增加基因轉染，滲透壓可改變基因復合物顆粒的粒徑，因此影響進入細胞的效率[28]。Sun等[29]研究推測低滲透壓還可以通過升高細胞內鈣離子濃度環節增強細胞對基因物質的攝取，從而增強細胞骨架運動方式，增加細胞內化活動，這樣的推測符合已有報道[30]。Elfinger等[31-33]發現在溶液中加入細胞受體的配體后，可以增加細胞對基因物質的吸收利用度。推測可能是增強細胞相應的功能后增加了細胞的內化作用，但其機理沒有作更深入研究。在動物模型上，霧化環節增加二氧化碳的濃度可以增強組織對基因轉染效率，但其具體原因尚不清楚[4]。推測二氧化碳與興奮呼吸中樞有關，但也不排除與改變酸堿度引起的納米顆粒的物理化學性質變化有關。Li等[34]在霧化中適當添加氨基酸，發現可以增強轉染效果，但機理仍不清楚。細胞功能可以影響細胞對外來基因物質的攝取過程，而細胞功能改變多伴隨細胞能量的代謝改變，自由基產生量會發生變化。通過氧自由基對基因物質攝取的影響研究發現，氧自由基促進細胞對基因物質的攝入，這種增加攝入是依賴于鈣調素激酶的活化引起細胞骨架變化而突現的。這一過程并不依賴于自由基引起的細胞鈣信號升高。該結果支持自由基直接誘導細胞骨架改變[35]。此外，細胞功能的調節也可以調節基因轉染效率。

四、霧化基因治療的應用

在臨床或動物模型上進行的霧化基因轉染實驗研究已經進行了多方面探討。基因載體有多種高分子聚合物，治療性的基因物質分為環形質粒和短鏈核苷酸。對動物機體進行的研究首先應明確的是外加基因能否表達、表達部位及機體安全性問題。Stribling等[36]指出：應用陽離子脂質體可以將質粒轉入鼠肺臟組織中，表達部位在氣管上皮，肺泡部位，同時強調該種方法不會引起組織學破壞。后來的研究表明，應用陽離子脂質體脂微球，進行肺組織基因轉染，轉染效果表明不受血清的影響，并可以保護DNA不被NDA酶破壞[13]。動物肺應用PEI進行基因修飾后可以得到更好的基因轉染效果[4]，Vaysse等[37]研究表明，氣管內皮細胞應用脂質體DOPAP將DNA與多肽P2結合，可使P2具有更高的基因表達。應用陽離子脂質體將重組人抗胰蛋白酶進行霧化吸入，7 d后可以在肺組織內檢測到mRNA和蛋白水平的表達[3]。McLachlan等[38]通過DOPT進行霧化吸入目的基因， 8～9 d后可以矯正基因的缺失，起到治療肺纖維化的作用。Gautam等[39]應用PEI包裹FITC標記的基因霧化后，檢測其在肺組織中的分布，發現24 h～28 d均有藥物分布。Jia 等[40]研究表明，PEI包裹的基因藥物可以12 h后表達IL，并在7 d后抑制腫瘤生長。有研究發現傳統的脂質體和PPDObREG可以增加轉染，抑制腫瘤生長。而新的方法表明PEGDA和分子PEI可以視基因在組織中的表達保持7 d左右[41]。

轉基因的表達時間大致在24 h到兩周時間內，其后有表達量逐漸減少趨勢。在研究在轉質粒類基因轉染治療疾病種類中對腫瘤疾病研究較多，研究人員應用PEI-P53復合物質粒實現了對動物模型腫瘤生長的抑制[42]。Mitchell等[43]研究表明：通過陽離子脂質體可使HIV-1表面質粒在肺上皮細胞表達，引起體液免疫和細胞免疫，但不引起DNA抗體，應用該方法可以作為一種免疫治療手段。Ma等[44]研究表明：霧化干擾素質粒可以調節小鼠肺部其他細胞因子的表達，推測通過該方法可以調節肺部局部免疫功能。Dames等[45]通過非病毒載體轉染糖皮質激素受體后可增加該類激素的治療效果。應用細胞周期調節信號的基因霧化方式PDCD4可以像抑制AP1方式一樣抑制腫瘤生長[46]。

針對寡核苷酸反義序列進行霧化也有報道，如：蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)的反義霧化治療可以抑制炎癥，推測該方法可以治療類似哮喘樣的炎性疾病[47]。Molet等[48]研究了反義藥物霧化后在肺組織中的分布，其主要分布于支氣管核肺泡的上皮細胞，同時也研究了其毒性作用。近些年，小RNA干擾技術的研究也在霧化吸入基因治療中得到應用，如應用霧化方式針對熒光酶素報告基因的干擾可以抑制80%～90%的基因表達[49]。針對Akt1 的干擾，應用siRNA可以抑制肺腫瘤的生長[50]。

肺臟的霧化基因吸入治療是系統性治療方法，需要更有利于基因完整性和產生更小顆粒的霧化機，以及具有組織深層滲透能力的基因物質載體。深入研究具有靶向性組織或細胞定位的轉染方式，對肺霧化吸入治療具有重要意義。無論是針對基因缺少的外源補充基因治療，還是反義或小RNA干擾技術，目的基因治療環節的選擇對正常組織和病變組織都是至關重要的，需要對機體和疾病更深入的了解，才能滿足臨床治療的需求。

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(本文編輯：黃紅稷)

孫文武，馬壯. 呼吸系統霧化基因治療研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 554-557.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.022

軍隊“十五”基金資助課題(01MB001)

110016 沈陽，沈陽軍區總醫院呼吸內科

馬壯，Email: Ma-tianyi@163.com

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2016-07-16)