Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)用于肺結(jié)核快速檢測(cè)的臨床研究

劉旭暉 張愛(ài)梅 盧水華

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·論著·

Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)用于肺結(jié)核快速檢測(cè)的臨床研究

劉旭暉 張愛(ài)梅 盧水華

目的探討Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)用于肺結(jié)核病快速檢測(cè)的診斷價(jià)值。 方法對(duì)上海市公共衛(wèi)生臨床中心呼吸科2014年7月至2015年4月收治的402例肺部疾病患者的呼吸道標(biāo)本進(jìn)行Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)檢測(cè)，選取以下四組人群進(jìn)行分析研究：①高度支持肺結(jié)核診斷的人群；②臨床排除肺結(jié)核診斷的人群；③常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)以及Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)提示利福平耐藥的人群；④留取下呼吸道樣本(支氣管鏡檢)的人群。所有患者都進(jìn)行了常規(guī)細(xì)菌學(xué)涂片、培養(yǎng)檢測(cè)進(jìn)行對(duì)照分析。結(jié)果Xpert MTB/RIF試驗(yàn)在本研究中總的敏感性為84.7% (95%CI, 0.81～0.88), 特異性為65.5% (95%CI, 0.51～0.78), 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.9% (95%CI, 0.91～0.96), 陰性預(yù)測(cè)值為40.4% (95%CI, 0.30～0.51)。 Xpert MTB/RIF試驗(yàn)比常規(guī)的細(xì)菌涂片+培養(yǎng)的方法敏感性更好 (84.7%vs. 58.8%,P<0.001). Xpert MTB/RIF試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了11.8%的利福平耐藥，與常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果無(wú)顯著差異。本研究中Xpert MTB/RIF試驗(yàn)對(duì)114例下呼吸道灌洗標(biāo)本的檢出率為79.8%(91例)，略高于上呼吸道標(biāo)本(70.2%，P=0.126)。結(jié)論Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)用于快速檢測(cè)肺結(jié)核病，其敏感性?xún)?yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法，并且能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)利福平耐藥的出現(xiàn)，是一種值得推薦的新檢測(cè)手段。Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)對(duì)下呼吸道標(biāo)本中結(jié)核菌的檢出率略高于上呼吸道標(biāo)本，兩者未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 肺結(jié)核； 耐藥性

對(duì)于發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)，結(jié)核病的負(fù)擔(dān)依舊沉重。抗結(jié)核藥物的耐藥率逐年上升，但是菌株耐藥性的檢測(cè)效率依然低下，結(jié)核病的快速診斷及耐藥性檢測(cè)是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的世界性難題[1-4]。對(duì)于結(jié)核菌及其耐藥性的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是抗酸染色鏡檢和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，抗酸染色的陽(yáng)性率低，敏感性差，結(jié)核桿菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)且陽(yáng)性率低，不能滿(mǎn)足快速診斷的需要。Xpert MTB/RIF試驗(yàn)以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因?yàn)榘谢颍稍?h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥，對(duì)于結(jié)核病的快速診斷有重要意義。本研究將不同臨床背景的人群進(jìn)行分組比較，旨在對(duì)Xpert MTB RIF試驗(yàn)的臨床診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。

對(duì)象和方法

一、 研究對(duì)象

對(duì)上海市公共衛(wèi)生臨床中心呼吸科從2014年7月至2015年4月收治的肺部疾病患者進(jìn)行篩選，納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①未進(jìn)行抗結(jié)核治療，能夠留取足夠的呼吸道標(biāo)本，有細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果; ②所有患者臨床資料、影像資料完整，最終診斷由臨床醫(yī)生、影像科醫(yī)生共同完成;③所有患者完成2個(gè)月隨訪(fǎng)對(duì)出院診斷進(jìn)行評(píng)估; ④排除HIV感染者。結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2013年發(fā)布的《肺結(jié)核診斷和治療指南》制定。

二、 樣本收集及檢測(cè)流程

留取患者清晨深部痰液標(biāo)本檢測(cè)，8 h內(nèi)進(jìn)行Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)及常規(guī)細(xì)菌涂片培養(yǎng)。下呼吸道灌洗液標(biāo)本處理方法同痰液。

1. Xpert MTB/RIF試驗(yàn)[5-7]：用勻漿器將痰液在生物安全柜條件下充分勻漿后，按1︰2比例加入標(biāo)配處理液，震蕩混勻(若混勻液粘稠，可適當(dāng)加大比例至呈均勻、無(wú)懸浮物液體)，室溫靜置15 min，取2 ml混合液轉(zhuǎn)移至一次性多室塑料反應(yīng)盒中。樣品自動(dòng)洗滌和過(guò)濾，自動(dòng)超聲破碎樣品，釋放核酸，DNA與PCR試劑混合，半巢式熒光定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，打印結(jié)果。

2. 常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)：痰標(biāo)本進(jìn)行抗酸涂片熒光顯微鏡檢測(cè)以及BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。

三、分組方法

根據(jù)研究對(duì)象的臨床資料及隨訪(fǎng)結(jié)果取以下四類(lèi)人群的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析：①高度支持肺結(jié)核診斷的人群，包括菌陽(yáng)肺結(jié)核和菌陰肺結(jié)核；②臨床排除肺結(jié)核診斷的人群，包括確診其他肺部疾病并治療有效者，以及不符合結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)并在隨訪(fǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)任何結(jié)核病依據(jù)者；③常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)以及Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)提示利福平耐藥的人群；④取下呼吸道樣本的人群，指通過(guò)纖維支氣管鏡留取支氣管灌洗液標(biāo)本的人群。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢測(cè)分析，以中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2013制定的結(jié)核病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為本研究的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及其95%置信區(qū)間。

結(jié) 果

本研究共納入402例患者，年齡15～84歲(中位年齡49歲)，男性257例，女性145例，其中114例支氣管灌洗液標(biāo)本獲得檢測(cè)結(jié)果。125例(31.1%)患者痰抗酸桿菌涂片(3次)陽(yáng)性；222例(55.2%)符合菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)，189例(47.0%)患者細(xì)菌培養(yǎng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；55例(13.7%)患者排除結(jié)核病診斷。Xpert MTB/RIF試驗(yàn)共檢測(cè)出了313例陽(yáng)性標(biāo)本，其中真陽(yáng)性294例，假陽(yáng)性19例，敏感性為84.7%(95%CI, 0.81～0.88)，特異性65.5%(95%CI, 0.51～0.78)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.9%(95%CI, 0.91～0.96)，陰性預(yù)測(cè)值40.4%(95%CI, 0.30～0.51)。Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢出率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)方法[84.7%(294/347)vs. 54.5%(189/347)，P<0.001]，同時(shí)顯著高于痰抗酸桿菌涂片+細(xì)菌培養(yǎng)的聯(lián)合檢出率[84.7%(294/347)vs. 58.8%(204/347)，P<0.001]。MTB/RIF試驗(yàn)在痰抗酸涂片陽(yáng)性患者中的檢出率高于在抗酸涂片陰性患者中的檢出率[91.2%(114/125)vs. 81.1%(180/222)，P=0.013]。

Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)出利福平耐藥率11.8%(41/347)，同時(shí)進(jìn)行的細(xì)菌培養(yǎng)檢出利福平耐藥率10.7%(37/347)，兩種檢測(cè)方法均檢出利福平耐藥者30例，MTB/RIF試驗(yàn)檢出而細(xì)菌培養(yǎng)未檢出耐藥11例，細(xì)菌培養(yǎng)檢出而MTB/RIF試驗(yàn)未檢出耐藥7例，兩種方法的檢出率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。30例吻合的結(jié)果中，同時(shí)合并異煙肼耐藥的菌株共有11株(36.7%)。

Xpert MTB/RIF試驗(yàn)對(duì)114例下呼吸道灌洗標(biāo)本中結(jié)核菌的檢出率為79.8%(91例)，略高于上呼吸道標(biāo)本(70.2%，P=0.126)。

討 論

一、Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的原理及優(yōu)越性

Xpert MTB/RIF試驗(yàn)以Gene Xpert系統(tǒng)平臺(tái)及以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，將rpoB基因做為靶基因，自動(dòng)提取DNA后擴(kuò)增rpoB基因的192 bp片段進(jìn)行檢測(cè)，采用6種分子信標(biāo)同時(shí)檢測(cè)6種探針，其中5個(gè)相互重疊的分子探針(分別以探針A-E命名)選擇性覆蓋rpoB基因的8l bp核心區(qū)，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌存在的同時(shí)可以探知利福平是否耐藥。Gene Xpert系統(tǒng)是一種封閉性及自動(dòng)化程度極高的檢測(cè)平臺(tái)，將標(biāo)本放入一次性反應(yīng)容器后不需要再次接觸檢測(cè)標(biāo)本，系統(tǒng)可自動(dòng)完成標(biāo)本純化、離心、DNA提取、DNA擴(kuò)增、DNA特異序列檢測(cè)、結(jié)果自動(dòng)讀出等多個(gè)程序，2 h內(nèi)可以完成檢測(cè)。這些特點(diǎn)都顯示出了超過(guò)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的優(yōu)越性，因此有潛在的推廣價(jià)值，目前世界衛(wèi)生組織已向全世界推廣這種檢測(cè)手段[8]。

二、Xpert MTB/RIF試驗(yàn)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核病的價(jià)值

Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的敏感性?xún)?yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌涂片及細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，而且檢測(cè)速度快，有利于結(jié)核病的早期診斷。尤其值得一提的是Xpert MTB/RIF試驗(yàn)在痰結(jié)核菌抗酸染色陰性的患者中具有高達(dá)81.1%的陽(yáng)性率，顯著提高了此類(lèi)患者的診斷效率，減少了結(jié)核病的漏診率。本研究獲得的特異度、陰性預(yù)測(cè)值均不理想，分別為65.5%和40.4%。這個(gè)結(jié)果可能源于非結(jié)核病組人群中Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的陽(yáng)性例數(shù)偏高(19/55)。這19例患者包括11例肺部感染，2例胸腔積液,2例肺部腫瘤， 4例非特異性炎癥。肺部感染及胸腔積液病例均在未使用抗結(jié)核藥物的情況下治療好轉(zhuǎn)并隨訪(fǎng)2月未復(fù)發(fā)，肺部腫瘤及肺部非特異性炎癥均有肺穿刺診斷。目前發(fā)表的多項(xiàng)研究中均提示Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的假陽(yáng)性率極低[9-17]，因此在本研究中發(fā)現(xiàn)的“假陽(yáng)性”病例有更可能是真的存在結(jié)核感染而目前的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不能確診的病例。對(duì)于這一點(diǎn)，可能與國(guó)內(nèi)高結(jié)核感染的背景有關(guān)，這些陽(yáng)性結(jié)果可能需要更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪(fǎng)才能最終確定。

三、非結(jié)核分枝桿菌對(duì)于Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的影響

目前我國(guó)常見(jiàn)的非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)包括堪薩斯分枝桿菌、鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌等，這些細(xì)菌廣泛存在自然界，并可能定植于肺部疾病患者的呼吸道中。部分非結(jié)核分枝桿菌中也存在rpoB基因或類(lèi)似基因，理論上有可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。目前在已發(fā)表的多項(xiàng)關(guān)于Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)報(bào)道中，非結(jié)核分枝桿菌造成假陽(yáng)性的比例僅為0.6%[9]，因此本研究中未將其作為結(jié)果影響因素進(jìn)行分析。

四、利福平耐藥性檢測(cè)

利福平作為最重要的抗結(jié)核藥物之一，其作用原理是抑制菌體上rpoB基因編碼的RNA聚合酶。幾乎所有利福平敏感菌株在該區(qū)域均具有相同的核酸序列，而95%以上的利福平耐藥菌株都有rpoB基因變異。rpoB基因變異引起利福平耐藥后，異煙肼出現(xiàn)耐藥的風(fēng)險(xiǎn)也明顯升高[18]。當(dāng)細(xì)菌對(duì)兩種最主要的抗結(jié)核藥物都出現(xiàn)耐藥時(shí)，肺結(jié)核的治療難度會(huì)極大增加。傳統(tǒng)的利福平耐藥檢測(cè)依賴(lài)于細(xì)菌培養(yǎng)，平均耗時(shí)超過(guò)15 d以上(本研究中的平均藥敏檢出時(shí)間為33 d)，而Xpert MTB/RIF試驗(yàn)可在2 h內(nèi)提供檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于耐藥的早發(fā)現(xiàn)有積極意義。本研究中，兩種方法檢測(cè)利福平耐藥的敏感性無(wú)明顯差異，有4例耐藥結(jié)果不吻合。此類(lèi)不吻合結(jié)果可能歸昝于表型耐藥檢測(cè)(細(xì)菌培養(yǎng))和基因耐藥檢測(cè)(Xpert MTB/RIF試驗(yàn))的差異性。表型檢測(cè)耐藥而基因檢測(cè)敏感的可能原因包括：①存在非rpoB編碼的耐藥位點(diǎn)、菌株細(xì)胞膜通透性改變、存在膜外排泵等；②表型敏感而基因檢測(cè)耐藥的可能由于基因的無(wú)明顯突變。

五、呼吸道標(biāo)本的選擇

本研究中下呼吸道灌洗液的結(jié)核菌陽(yáng)性檢出率略高于上呼吸道標(biāo)本，兩者未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于本研究中選取的樣本量有限，而且進(jìn)行支氣管灌洗的患者多有明顯支氣管病變，不能完全代表一般肺部疾病患者的情況，本研究不能充分判斷灌洗液是否有更好的檢測(cè)價(jià)值，需要更多相關(guān)研究證實(shí)。同時(shí)應(yīng)認(rèn)識(shí)到肺結(jié)核病是臨床上常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，如何提高肺結(jié)核的診斷率，防止誤診、漏診是臨床上不可忽視一個(gè)重要問(wèn)題，特別注意加強(qiáng)肺結(jié)核的防治工作[19-20]。

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(本文編輯：王亞南)

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LiuXuhui,Email:liuuhui@shaphc.org

Objective To evaluate the clinical performance of Xpert MTB/RIF Assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods During July, 2014 to April, 2012, 402 cases with pulmonary diseases were involved in this study and respiratory tract specimens were carefully tested. Four groups were identified to analyze: (1) patients with clinical diagnosis of pulmonary tuberculosis; (2) patients clinically excluded from pulmonary tuberculosis; (3) patients with rifampin resistance; (4) patients with bronchial larvae specimen tested. All cases were not treated with anti-tuberculosis drugs before specimen collection and paired specimens were acid fast stained and cultured by Bactec MGIT 960 system. Result The overall sensitivity of Xpert MTB/RIF Assay in this study is 84.7% (95%CI, 0.81 to 0.88), specificity is 65.5% (95%CI, 0.51 to 0.78), positive predict value is 93.9% (95%CI, 0.91 to 0.96), negative predict value is 40.4% (95%CI, 0.30 to 0.51). Xpert MTB/RIF Assay is more sensitivity than traditional culture and acid fast stain method (84.7%vs. 58.8%,P<0.001). Rifampin resistance identified by Xpert MTB/RIF Assay is 11.8%, which shows no significant difference with culture method (10.7%,P=0.72). Lower respiratory tract specimens have relatively higher MTB/RIF Assay positive rate than upper respiratory tract specimens, but no significant difference (P=0.126). Conclusion Xpert MTB/RIF test for rapid detection of tuberculosis bacteriology detection method of the sensitivity is better than the traditional, and can accurately predict the emergence of Rifampicin resistance, it can be recommended as a new means of detection. Xpert MTB/RIF test of Mycobacterium tuberculosis in lower respiratory tract specimens detection rate is slightly higher than that of the upper respiratory tract specimens, while there is no significant difference.

Xpert MTB/RIF Assay; PCR; Tuberculosis; Drug resistance

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.012

201508 上海市公共衛(wèi)生臨床中心呼吸科

劉旭輝，Email: liuuhui@shaphc.org

R563

A

2015-08-10)

Clinical evaluation of using Xpert MTB/RIF assay as a rapid diagnosis of tuberculosisLiuXuhui,ZhangAimei,LuShuihua.Respiratorydepartment,ShanghaiPublicHealthClinicalCenterAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai201508,China